Journal Archive

개다래나무는 한국 각지에 분포되어있으며 개다래나무의 열매인 목천료는 류마티스 관절염과 통풍, 알레르기, 이뇨제, 고혈압 등의 치료에 사용되어 왔다고 알려져 있다^1,2). 현재까지 보고된 개다래나무 활성에 관한 연구로는 개다래나무 열매의 항염 및 항천식 효능³⁾이 보고되었고, 성분연구로는 ursolic acid, 3-0-acetylursolic acid, umbelliferone 등 triterpenoid 계열과 phenylpropanoid 계열 및 여러 phenolic 화합물이 함유되어 있다고 보고 되었다^4,5). 개다래나무에 관한 최근 연구에 따르면 목천료에서 분리한 트리테르펜이 LPS로 자극한 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포 두 세포주 모델에서 일산화질소 생성을 억제한다고 보고하고 있으며²⁾, 염증 억제에 관한 연구는 미비한 실정이다.

염증 반응은 우리 몸의 면역계가 외부 자극에 대한 생체의 정상적인 방어 기작이며, 천식이나 염증성 장질환, 동맥경화 및 관절염 등처럼 여러 질병의 유발 원인이 된다고 알려져 있다^6-8).특히 중추신경계(central Never system, CNS)의 염증은 뇌에 존재하는 세포나 말초로부터 면역세포의 침윤에 의해 유발되며, microglia는 이러한 중추신경계의 염증반응에 관여하는 세포이다. 특히, microglia는 형태학적으로 대식세포와 유사하여 탐식능이 있고, 노폐물처리를 담당하는 기능이 있으며 신경성장 인자를 분비하여 신경세포 보호 및 CNS의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다^9,10). 그러나 microglia의 활성화는 본질적으로 긍정적인 치유 과정이지만 활성화 상태가 장기간 지속되거나 과도하게 활성화가 유도될 때에는 진행성 염증반응을 일으켜 nitric oxide (NO), prostaglandin E2(PGE2) 염증성 매개 인자 및 tumor necrosis alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 및 interleukin-6 (IL-6) 등과 같은 염증성 cytokine과 reactive oxygen species (ROS) 등을 분비함으로써 신경 독성을 유발하고 뇌실질 조직을 손상시킴으로서^11-13), 알츠하이머 치매, 파킨슨씨병 같은 신경퇴행성 질환의 원인이 된다고 보고되고 있다^14-16). 염증성 매개인자인 NO와 PGE2는 각각 inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 생산되므로 이들 염증성 유전자와 함께 그 산물을 효과적으로 조절할 수 있는 시료에 관한 연구는 신경염증 조절뿐만 아니라 신경퇴행성 질환의 치료에 관한 기본 연구가 될 수 있다. 특히 NO 생성을 억제할 수 있는 연구 방법은 항염증 시료의 시험법의 기본으로 인정되고 있다.

따라서, 본 연구에서는 mouse microglia BV2 세포에 lipopolysaccharide (LPS)를 이용하여 microglia의 활성화를 통하여 염증반응을 유도한 후 목천료 추출물이 염증 저해 활성을 보이는지 확인하였다. 그 결과 목천료 추출물이 iNOS, COX-2 및 염증성 cytokine의 발현과 MAPK 기전을 통하여 그 최종 산물을 억제하였음으로 신경염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있을 가능성을 확인하였기에 이를 보고하는 바이다.

신경교세포 또는 신경아교세포(glial cell)는 신경계를 구성하는 세포 중 신경세포가 아닌 세포들을 일컫는다. 신경퇴행성질환에서 신경교세포가 정상기능을 잃거나 독성을 띠는 이상기능을 나타내는 것이 전반적인 신경세포의 퇴행에 영향을 미친다¹⁷⁾. 뇌졸중에서도 신경교세포와 관련하여 병변 부위의 염증반응이 활성화되고 이러한 기전이 부종을 유발하고 신경학적 증상을 가중시키므로, 신경교세포와 관련한 다양한 염증 부산물을 줄이고 연쇄반응을 막아서 그로인한 증상을 경감시키고 손상을 막을수 있는 치료 방안에 대한 연구가 필요하다. 이에 대하여 임상에서 활용되고 있는 한약 복합처방과 한약 단미를 활용한 연구 뿐만 아니라, 추출물로부터 분리된 다양한 분획물을 이용한 신경교세포에서의 염증반응 억제효과를 확인하는 연구가 진행되었다¹⁸⁾.

목천료자(木天蓼子)는 개다래나무 열매로, 개다래나무는 다래나무과(Actinidiaceae)에 속하는 낙엽덩굴이고, 열매는 종종 개다래나무 진딧물(Asphidyliamatatabi)의 알이 부화하여 성장하여 불규칙한 벌레주머니 모양처럼 보인다. 목천료에는 triterpene류가 함유되어 있고, 열매에는 ceramide인 actinidiamide와 불포화지방산인 alpha-linolenic acid가 함유되어 있으며, 비만, 알레르기, 염증 및 천식 등을 조절하는 효과가 보고되었다¹⁹⁾.

중추신경의 퇴행성 질환과 뇌졸중 등 각종 노인성 질환 치료 및 예방에 있어서 신경교세포와 관련한 염증기전에 대한 연구가 주요할 것으로 판단하여, 항염증, 항알레르기, 항천식 작용이 있는 것으로 알려진 목천료자를 이용하여 mouse BV2 cell에서 산화물질의 발현, 염증반응 매개체들의 반응을 관찰하였다.

본 연구에 앞서 세포의 독성을 평가하기 위해 목천료를 3가지 방법 (물, 50%에탄올, 100%에탄올)으로 추출하여 이 중 BV2 세포를 사용하여 독성이 없는 농도에서 신경염증 활성 억제에 관한 효과를 확인하였다.

NO는 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 L-arginine로부터 합성되는 라디칼로서, 세포 신호전달에 중요한 물질이며 생체 내 고농도로 NO가 생성되면 염증반응에 의한 조직의 상해, 패혈증 및 자가 면역 질환을 초래할 수도 있다^20,21).

BV2 세포에 LPS를 처리하였을 때 NO 함량은 무처리군에 비해 7배 증가하는 것을 확인하였고, BV2 세포에 목천료 물추출물을 농도별로 처리한 결과 LPS 처리 대조군에 비해 NO 함량이 감소하였다. 특히 100% 에탄올 추출물에서 목천료추출물 농도가 높을수록 NO 생성량을 억제하는 결과가 나타났으나, 이는 세포 독성과 유관한 것으로 판단하였으며, NO 생성억제 효과가 양호하면서 세포 독성이 없는 적정 용량을 찾고자 하였다. 따라서, 100%에탄올 추출물 50 μg/mL의 농도를 최고 농도로 하여 NO assay를 재수행 하였고 그 결과 목천료 100%에탄올 추출물은 LPS로 유도된 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 확인하였다. 이후 실험에서는 100%에탄올 추출물을 이용하여 독성이 없는 농도인 50 μg/mL을 최고 농도로 하여 진행하였다.

iNOS는 Ca²⁺ 비의존성 경로를 통하여 다량의 NO를 생성하며, iNOS의 발현은 macrophage, 내피세포, 심근세포, 평활근세포 등 여러 세포에서 발견되고 있다²²⁾. iNOS는 면역 관련된 역할을 수행하는 단백질로 염증성 cytokine들이나 LPS등에 의해 세포가 자극되면 발현되며, 과도한 iNOS의 발현은 NO의 생성량을 증가시켜 염증반응을 유도한다.

다수의 항염증 약물들의 작용기전이 되는 COX-2 생성억제를 살펴본 결과, 목천료 100%에탄올 추출물은 LPS에 의해 발현되는 COX-2 단백질을 50 μg/mL의 농도에서 유의성 있게 억제하였음을 확인할 수 있었다.

MAPK(mitogen-activated protein kinase)는 LPS 등 다양한 자극에 대해 활성화되고 세포 핵내에서 전사인자로 역할하며 특히 세포의 성장, 사멸 및 분열에 중요한 역할을 한다²³⁾. MAPK family에는 대표적으로 Extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (p38) 세 가지 효소가 있다²⁴⁾.

LPS는 gram-negative 세균의 세포벽 구성성분으로 강한 염증반응을 일으키며 대식세포 표면의 TLR4를 자극하여 하부 세포신호전달경로인 mitogen-activated protein kinase(MAPK)의 활성화를 유도하며 활성화된 신호전달경로는 pro-inflammatory cytokines, NO, prostaglandin (PG)s와 같은 여러 가지 염증성 매개 인자들을 발현시킴으로써 면역계 기능의 장애를 초래하게 된다.

목천료 추출물이 MAPK 신호전달과 관련이 있는지 알아보기 위하여 western blot 방법을 이용하여 MAPK 단백질의 발현을 비교해 본 결과, BV2 세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도하였을 때, 인산화된 p38, JNK, ERK가 대조군에 비해 증가 되었으며 목천료 에탄올 추출물을 전처리하였을 때는 p-p38, p-JNK가 농도 의존적으로 억제되었다. 이와 같은 결과는 목천료 에탄올 추출물이 MAPK 신호전달 경로를 통하여 염증을 감소시키고 있다고 해석할 수 있다.

염증은 주요 매개자인 염증성 사이토카인(Inflammatory cytokine)을 분비하여 염증반응의 증폭과 지속을 조절하는데, IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환의 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 하며, TNF-α는 염증반응 초기에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증반응을 일으키고 악화시키는 인자이다²⁵⁾.

염증과 관련된 대표적인 사이토카인인 IL-6와 TNF-α를 측정한 결과도 목천료 에탄올 추출물을 전처리하였을 때 농도 의존적으로 사이토카인의 방출량이 줄어드는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 항염증 물질의 연구에 기초 자료로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

위의 결과를 종합하여 볼 때, 목천료 추출물은 과도한 염증반응 억제에 효능이 있으며 이는 목천료 추출물이 신경염증 억제에 관한 시료로 연구 가능성이 있을 것으로 판단 된다. 이후 후속 연구를 통하여 목천료 에탄올 추출물의 신경염증 억제 효능의 중심 성분 연구가 필요할 것으로 사료 된다.

본 연구는 mouse microglia BV2 세포에 lipoploysaccharide (LPS)를 이용하여 microglia의 활성화를 통해 염증반응을 유도 한후, 목천료 추출물을 처치하여 산화 물질의 발현 및 신경염증 활성 억제 효과가 있는지 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

목천료 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였고, LPS에 의해 발현되는 COX-2 단백질을 목천료 에탄올 추출물 50 μg/mL의 농도에서 유의성 있게 억제하였다. MAPK 단백질의 발현을 비교해 본 결과, 목천료 에탄올 추출물을 전처리하였을 때는 p-p38, p-JNK가 농도 의존적으로 억제되었다. 염증과 관련된 사이토카인 IL-6와 TNF-α를 측정한 결과도 목천료 에탄올 추출물을 전처리하였을 때 농도 의존적으로 사이토카인의 방출량이 줄어들었다.

이상의 결과를 미루어 보아 목천료 추출물은 신경염증 억제 효과 있는 것으로 사료되고 향후 신경염증을 기전으로 발생하는 각종 질환에 응용가능한지 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.