Journal Archive

과루인은 ㈜본초마루(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 먼저 분말로 곱게 파쇄한 과루인 50 g에 80% 에탄올 800 ㎖을 넣고 초음파세척기에서 20분간 sonication 하였다. Sonication 3회 반복 후 40℃ 인큐베이터에서 120 rpm으로 교반시키며 48시간 동안 추출하였다. 추출액을 여과하여 모은 후 남은 과루인 분말에 다시 80% 에탄올 300 ㎖를 넣어 40℃ 인큐베이터에서 2차 추출하였다. 2차 추출액은 여과 후 1차 추출액과 합쳐 감압농축 및 동결건조하였다. 최종적으로 2.69 g의 추출분말을 얻어 5.38%의 수율을 나타내었다. 추출분말을 dimethylsulfoxide (DMSO; Amresco, Solon, OH, USA)에 100 ㎎/㎖로 녹인 후 사용하였으며, 이를 ESTK (ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii)라고 명명하였다.

HUVEC 인체 제대정맥 내피세포는 부경대학교 김군도 교수님으로부터 분양받았고, H1299 인체 폐암세포주는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. HUVEC 세포주는 VascuLife® VEGF Endothelial Medium Complete Kit (Lifeline Cell Technology, Frederick, MD, USA)를 사용하여 배양하였다. H1299 세포는 RPMI-1640 (WelGENE, Seoul, Korea) 90%에 fatal bovine serum (FBS; WelGENE) 10%와 penicillin-streptomycin (WelGENE) 1%를 첨가하여 배양하였다. 두 세포주 모두 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 2~3일에 한 번 주기로 계대배양하였다.

96 well plate에 HUVEC 세포를 1×104개씩 분주하였다. 다음 날 ESTK를 농도별(0, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포배양액에 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide (MTT; Duchefa, Haarlem, The Netherlands)를 0.4 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 세포배양액을 제거하고, DMSO 100 ㎕를 주입하여 바닥에 형성된 formazin을 용해시켰다. 흡광도는 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.

24 well transwell (8.0 ㎛ pore size; Corning, NY, USA) insert의 outer membrane을 0.1% gelatin (Sciencell, Carlsbad, CA, USA)으로 코팅하였다. 그 다음 HUVEC 세포를 serum이 포함되지 않은 배지에 현탁한 후 transwell의 insert에 5×104개씩 분주하면서 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하였다. Bottom chamber에는 유인인자(chemoattractant)로서 H1299 세포주로부터 모은 conditioned medium을 500 ㎕씩 분주하였다. 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 insert를 꺼내 methanol로 5분간 고정하고, hematoxylin (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)으로 30분간 염색하였다. 그 후 insert를 증류수로 수차례 세척하고 안쪽 면은 면봉으로 닦아냈다. Gelatin 상에 고정된 염색된 세포들을 이동한 세포로 간주하여 100배율의 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하면서 계수하였다. H1299 세포의 conditioned medium은 아래와 같은 방식으로 준비하였다. H1299 세포를 100 π dish에 분주하고, 세포밀집도가 90%가 될 때까지 배양한 다음 세포배양액을 제거하고 serum이 포함되지 않은 RPMI-1640 배지 5 ㎖을 넣어주었다. 24시간 배양 후 세포배양액을 모아 여과하여 conditioned medium으로 사용하였다.

6 well plate에 HUVEC 세포를 2×105개씩 분주하고 안정화시킨 후 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 배양하였다. 다음 날, 96 well plate에 growth factor reduced matrigel (Corning)을 50 ㎕ 분주하여 굳힌 후 ESTK가 전처리된 HUVEC 세포를 0.25% trypsin-EDTA (WelGENE) 처리로 떼어내 1.5×10⁴개씩 matrigel 위에 분주하였다. 37℃ 인큐베이터에서 10시간 배양 후 tube formation 정도를 50배율의 현미경으로 관찰하였다.

6 well plate에 HUVEC 세포를 2×10⁵개씩 분주하고 안정화시킨 후 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 24시간 처리하였다. 하베스트 30분 전 VEGF (20 ng/㎖)를 처리하여 VEGFR2를 활성화시켰다. 각 well의 세포배양액을 제거한 후 phosphate buffer saline (PBS, WelGENE)로 2회 세척하고, protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)과 phosphatase inhibitor (1 mM Na3VO4, 100 mM NaF)가 첨가된 RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific)를 200 ㎕씩 분주하여 단백질을 분리하였다. Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)의 사용법에 따라 단백질을 정량하였고, 각 샘플당 20 ㎍의 단백질을 8% gel 상에 전기영동하였다. 이와 같이 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore Corporation, Bedford, MA)으로 transfer하고, 3% bovine serum albumin (BSA, GenDEPOT, TX, USA)으로 blocking 한 다음 1차 항체(1:1000 희석)와 4℃에서 overnight 반응시켰다. 다음 날 TBST (Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20)로 멤브레인을 수차례 세척하고 2차 항체(1:5000 희석)와 실온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBST로 수차례 세척하였다. 단백질 발현은 D-Plus ECL Femto System (Donginbio, Seoul, Korea)을 사용하여 확인하였다. Phosphorylated VEGFR2 및 total VEGFR2 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Goat anti‑rabbit 2차 항체는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였고, goat anti‑mouse 2차 항체는 Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA)에서 구입하였다.

6 well plate에 H1299 세포를 2×10⁵개씩 분주하여 안정화시킨 후 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하였다. 각 well의 세포배양액을 제거한 후 PBS로 2회 세척하고 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. Microplate reader (Molecular Devices)로 RNA 정량 후 1 μg total RNA를 PrimeScript RT reagent kit (Takara, Japan)의 사용법에 따라 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 nuclease-free water에 1:50으로 희석하여 타겟유전자에 대한 primer 및 SYBR green (Enzynomics, Daejeon, Korea)과 혼합하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 quantitative real-time PCR 분석을 시행하였다. 사용된 primer 서열과 annealing temperature는 Table 1과 같다.

모든 실험 결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 표시하였으며, Student’s t-test를 이용하여 P < 0.05인 것을 통계적으로 유의성 있다고 판단하였다.

먼저 HUVEC 세포의 증식에 영향을 미치지 않는 ESTK의 농도 조건을 설정하기 위하여 HUVEC 세포에 ESTK를 다양한 농도(0, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 24시간 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과 ESTK 25, 50, 100 ㎍/㎖ 처리군에서 세포생존율이 각각 99.62±3.22%, 92.72±0.88%, 90.78±4.46%로 나타나 HUVEC 세포의 증식에 미치는 영향이 미미한 것으로 판단되었다 (Fig. 1). 이에 ESTK 100 ㎍/㎖를 최고농도로 하여 이후 실험을 진행하였다.

Fig. 1. 
Effect of ESTK on the cell viability of HUVECs. HUVECs were treated with various concentrations of ESTK (0, 25, 50, 100 ㎍/㎖) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. The data are expressed as the means ± SD of 3 independent experiments. The dotted line indicates the cell viability of 90%. HUVEC, human umbilical vein endothelial cells; ESTK, ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii.

혈관신생 과정에서 혈관내피세포의 이동은 필수적이다. 일반적으로 VEGF, FGF, angiopoietin과 같은 인자가 혈관내피세포를 혈관신생이 필요한 곳으로 유인한다⁶⁾. 암세포는 이러한 유인인자들을 활발히 분비함으로써 혈관내피세포들이 종양이 위치한 곳으로 이동하여 신생혈관을 형성할 수 있도록 한다¹¹⁾. 이에 ESTK가 HUVEC 세포의 이동에 미치는 영향을 조사하기 위해 transwell assay를 시행하였다. 먼저 HUVEC 세포가 transwell의 bottom chamber로 이동할 수 있도록 유인하는 인자로서 H1299 인체 폐암세포주의 conditioned media (CM)를 사용하였다. Upper chamber에는 HUVEC 세포를 분주하면서 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 동안 이동한 세포수를 확인하였다 (Fig. 2A). 그 결과 ESTK를 처리하지 않은 대조군에서는 H1299 세포의 CM에 의해 HUVEC 세포가 활발히 이동하였으나, ESTK 50, 100 ㎍/㎖ 처리군에서는 대조군에 비해 각각 75.34±4.92%, 16.04±0.69%로 이동능이 유의하게 감소하였다 (Fig. 2B and 2C). 이러한 결과는 ESTK가 종양에서 분비되는 다양한 유인인자에 의해 혈관내피세포가 암으로 활발히 이동하는 것을 억제할 수 있음을 시사한다.

Fig. 2. 
Effects of ESTK on the migration of HUVECs. (A) Experimental scheme of transwell assay is shown. HUVECs suspended in serum free medium were seeded into the inserts of 24 well transwell plate and treated with ESTK (0, 50, 100 ㎍/㎖) for 24 h. Conditioned media collected from H1299 human lung cancer cells were filled in the bottom chamber. (B) HUVECs that migrated through the intermembrane were stained and photographed under a microscope (×100 magnification). (C) The relative migration was evaluated by counting the migrated HUVECs. The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (***P < 0.001 versus untreated control). HUVEC, human umbilical vein endothelial cells; ESTK, ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii; CM, conditioned media.

ESTK가 혈관내피세포의 관 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 ESTK를 HUVEC 세포에 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리한 후 tube formation assay를 시행하였다. 그 결과 대조군에서는 견고한 관형 구조가 형성되었으나, ESTK를 처리한 군에서는 관 형성이 농도의존적으로 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 3A). ESTK 50, 100 ㎍/㎖ 처리군에서 관 형성도는 대조군에 비해 각각 26.63±11.11%, 22.22±7.41%로 유의하게 감소하였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 ESTK가 혈관내피세포의 관 형성을 억제할 수 있음을 보여준다.

Fig. 3. 
Effects of ESTK on the tube formation of HUVECs. (A) HUVECs pretreated with ESTK (0, 50, 100 ㎍/㎖) for 24 h were seeded onto the matrigel-coated 96 well plate. After 10 h of incubation, the tube formation was photographed under a microscope (×50 magnification). (B) The relative tube formation was evaluated by counting the number of branch sites/nodes. The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (**P < 0.01, ***P < 0.001 versus untreated control). HUVEC, human umbilical vein endothelial cells; ESTK, ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii.

VEGFR2는 VEGF와 결합하여 혈관신생을 매개하는 가장 주요한 수용체이다. VEGFR2는 혈관내피세포의 생존과 증식, 이동과 침윤, 그리고 관 형성에 이르기까지 거의 모든 과정에서 혈관신생을 촉진한다. 이에 VEGFR2는 암의 혈관신생을 억제하기 위한 핵심 표적이 되어왔다¹²⁾. VEGFR2는 여타 티로신키나제수용체(tyrosine kinase receptor)와 같이 리간드와 결합하면 이합체를 형성(dimerization)하면서 내부의 티로신키나제 활성을 유발하여 자가인산화 되는 동시에 하위로 신호를 전달한다¹³⁾. 이에 ESTK가 VEGF 처리로 유도한 VEGFR2 인산화를 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 시행하였다. 먼저 HUVEC 세포에 VEGF를 처리하자 대조군에 비해 VEGFR2의 인산화가 확연히 증가하는 것을 확인하였다. 이는 ESTK 전처리에 의해 농도의존적으로 유의하게 감소하였다 (Fig. 4A and 4B). 또한 ESTK는 total VEGF 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (Fig. 4A). 이러한 결과는 ESTK가 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화를 억제시킴으로써 혈관내피세포의 이동과 관 형성을 억제함을 시사한다.

Fig. 4. 
Effects of ESTK on the phosphorylation of VEGFR2 in HUVECs. (A) HUVECs were treated with ESTK (0, 50, 100 ㎍/㎖) for 24 h and stimulated with VEGF (20 ng/㎖) 30 min before harvest. The phosphorylation level and total expression of VEGFR2 were detected by Western blot analysis. Actin was used as an internal control. (B) The ratio of phosphorylated/total VEGFR2 was calculated using ImageJ software after normalization to actin. The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (###P < 0.01 versus untreated control, ***P < 0.001 versus VEGF-treated cells). HUVEC, human umbilical vein endothelial cells; ESTK, ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii; VEGF, Vascular endothelial growth factor; VEGFR2, VEGF receptor 2.

마지막으로 혈관내피세포의 이동과 관 형성을 촉진하는 다양한 인자들의 암세포 내 발현을 ESTK가 조절할 수 있는지 확인하였다. 암세포에서 분비되는 혈관신생 촉진인자로서 VEGF, FGF, angiopoietin, PGF, PDGF, angiogenin, TNF-α 등이 알려져 있다¹⁴⁾. VEGF는 VEGFR2를 통해 혈관신생을 촉진하는 가장 대표적인 인자로서 혈관신생 억제를 위한 항체치료제의 주요 타겟이 되어 왔다⁶⁾. FGF2는 FGF 수용체를 통해 혈관내피세포의 증식과 이동을 촉진하며, VEGF나 angiopoietin과 같은 인자들을 분비시킴으로써 간접적으로 혈관신생을 돕는다¹⁵⁾. Angiopoietin은 혈관내피세포의 액틴 리모델링을 통해 이동을 촉진하고, pericyte를 활성화시키는 사이토카인을 분비시킨다¹⁶⁾. PGF는 VEGF family의 하나로서 VEGFR1과 결합하여 혈관내피세포의 이동을 촉진하고, VEGFA가 VEGFR2와 결합하도록 유도하며, 대식세포, pericyte 등 혈관신생을 일으키는 기질세포들을 유인하는 역할을 한다¹⁷⁾. PDGF는 각종 암에서 높게 발현되며, 종양조직을 구성하는 암세포와 혈관내피세포 및 기질세포의 성장과 전이에 작용하여 암의 불량한 예후와 연관되어 있다¹⁸⁾. Angiogenin과 TNF-α 역시 혈관내피세포의 성장, 이동, 침윤 및 관 형성을 촉진하며, 암세포에서는 혈관신생 촉진인자의 분비를 유도한다고 알려져 있다^19,20). 이에 H1299 인체 폐암세포주에 ESTK를 농도별(0, 50, 100 ㎍/㎖)로 24시간 처리한 후 상기한 촉진인자들의 mRNA 발현이 조절되는지 여부를 real-time PCR로 확인하였다. 그 결과 Fig. 5에 나타난 바와 같이 ESTK가 H1299 세포에서 VEGFA, FGF2, angiopoietin, PGF, PDGFA, PDGFB, angiogenin, TNF-α의 mRNA 발현을 농도의존적으로 억제함을 알 수 있었다 (Fig. 5A-H). 박¹⁰⁾의 연구에서도 과루인 에탄올 추출물이 저산소환경에서 암세포의 Hif-1α와 VEGF의 발현을 감소시킨다고 보고하여 본 연구결과와 일치하는 부분이라고 할 수 있다. 따라서 상기한 결과는 ESTK가 암세포에서 분비되는 혈관신생 촉진인자들을 억제함으로써 궁극적으로 혈관신생을 저해할 수 있음을 시사한다.

Fig. 5. 
Effects of ESTK on the mRNA expression of angiogenic factors in H1299 cells. H1299 human lung cancer cells were treated with ESTK (0, 50, 100 ㎍/㎖) for 24 h. The mRNA expression of angiogenic factors, including VEGFA (A), FGF2 (B), angiopoietin (C), PGF (D), PDGFA (E), PDGFB (F), angiogenin (G), TNF-α (H), was detected by real-time PCR. ESTK, ethanolic extract of the seeds of Trichosanthes kirilowii; VEGFA, Vascular endothelial growth factor A; FGF2, fibroblast growth factor 2; PGF, placental growth factor; PDGF, platelet derived growth factor; TNF-α, tumor necrosis factor.