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Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine - Vol. 36 , No. 1
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[ ORIGINAL ARTICLES ]
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine - Vol. 36, No. 1, pp. 1-6
Abbreviation: J Physiol & Pathol Korean Med
ISSN: 1738-7698 (Print) 2288-2529 (Online)
Print publication date 25 Feb 2022
Received 09 Jan 2022 Revised 10 Feb 2022 Accepted 10 Feb 2022
DOI: https://doi.org/10.15188/kjopp.2022.02.36.1.1

반하 추출물의 종양연관대식세포 조절을 통한 암세포 이동능 저해 효과
박신형*
동의대학교 한의과대학 병리학교실

The Tuber Extract of Pinellia ternata (Thunb.) Brei Suppresses Cancer Cell Migration by Regulating Tumor-associated Macrophages
Shin-Hyung Park*
Department of Pathology, College of Korean Medicine, Dong-eui University
Correspondence to : *Shin-Hyung Park, Department of Pathology, College of Korean Medicine, Dong-eui University, YangJeong-ro, Busanjin-gu, Busan, Republic of Korea ·E-mail : omdpark@deu.ac.kr ·Tel : +82-51-890-3332


Ⓒ The Society of Pathology in Korean Medicine, The Physiological Society of Korean Medicine
Abstract

The tuber of Pinellia ternata (Thunb.) Brei (TPT) used in traditional Oriental medicine for the treatment of cough, sputum, vomiting, and insomnia, possesses antioxidant, antibacterial, and anti-inflammatory effects. Although recent studies have reported the anticancer effects of TPT in several cancer cells, it is still unclear whether TPT regulates tumor-associated macrophage (TAM) characterized by the immunosuppressive M2 macrophage phenotype. Our results showed that the ethanol extract of TPT (ETPT) suppressed the migration of RAW264.7 mouse macrophage cells and THP-1 human monocytes differentiated into macrophages towards the conditioned media (CM) collected from lung cancer cells, suggesting that ETPT would attenuate the recruitment of macrophages into tumors. In addition, ETPT suppressed the interleukin (IL)-4 or IL-6-induced M2 macrophage polarization in RAW264.7 cells. ETPT treatment not only downregulated the mRNA expression of M2 macrophage markers including arginase-1, mannose receptor C type 1 (MRC-1), and IL-10, but also inhibited the phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and STAT6, general regulators of M2 macrophage polarization. Finally, the transwell assay results showed that the CM from M2-polarized RAW264.7 cells increased the migration of mouse lewis lung carcinoma (LLC) cells, while those from RAW264.7 cells co-treated with ETPT and IL-6 significantly reduced the migration of LLC cells. Taken together, our observations clearly demonstrate that ETPT suppressed the cancer cell migration by regulating macrophage recruitment and M2 macrophage polarization.

Keywords: Tuber of Pinellia ternata (Thunb.) Brei, Tumor-associated macrophage, M2 macrophage, Cancer cell migration
서 론

종양연관대식세포(tumor-associated macrophage, TAM)는 골수유래 단핵구가 혈중을 순환하다 암세포가 분비하는 다양한 케모카인(chemokine) 혹은 사이토카인(cytokine)에 의해 종양으로 유인되어 대식세포로 분화한 것이다. 최근 연구에 따르면 골수유래 단핵구 뿐만 아니라 배아에서 유래하여 조직에 상주하던 대식세포가 종양조직으로 침윤하여 종양연관대식세포를 구성하기도 한다1,2). 종양연관대식세포는 종양미세환경의 핵심 구성원으로서 종양 침윤 면역세포 중 가장 높은 비율을 차지하고 있다3). 종양연관대식세포의 존재는 다양한 암종에서 보고되어 있으며, 종양의 성장과 전이 및 항암제 내성과 밀접한 연관을 가짐이 보고되어 있다4,5).

종양연관대식세포는 크게 M1형과 M2형으로 분극될 수 있다. M1형 대식세포는 박테리아 산출물이나 interferon(IFN)-γ와 같은 신호에 반응하여 적응면역계(adaptive immune system)를 활성화시키며 타겟세포를 탐식하는 등 전형적인 면역기능을 가진다6). M1형 대식세포는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이나 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 독성물질을 분비하여 암세포를 직접적으로 공격함으로써 항암작용을 가지는 것으로 알려져 있다7). M2형 대식세포는 interleukin(IL)-4, IL-13, transforming growth factor(TGF)-β 등에 반응하여 분극되며, 어떤 인자에 의해 분극되느냐에 따라 M2a, M2b, M2c 및 M2d형으로 분류된다. M2형 대식세포는 IL-10과 같은 항염증인자들을 분비하여 면역계가 암세포를 공격하는 것을 억제하며, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등을 분비하여 혈관신생과 암세포의 전이를 촉진함으로써 암을 악화시키는 것으로 알려져 있다6,8). 암세포 및 종양미세환경에서 분비되는 다양한 인자들이 M2형 대식세포로의 분극을 유도하므로 종양연관대식세포의 종양 내 침윤은 암의 불량한 예후와 관련이 깊다4-6). 따라서 종양연관대식세포를 조절하는 것이 새로운 항암전략으로 대두되고 있는데, 대표적 전략으로서 대식세포가 종양 내로 유인되는 것을 억제하거나 종양연관대식세포의 M2형 분극을 조절하는 것 등이 제안되고 있다4,6).

반하(半夏)는 천남성과(天南星科)에 속한 다년생초본으로 Pinellia ternata (Thunb.) Brei의 괴경(塊莖)을 건조한 것이다.『신농본초경(神農本草經)』에 최초로 기재된 후 한방 임상에서 매우 빈용되는 약재이며, 온신유독(溫辛有毒)한 성질을 가지고, 비위폐(脾胃肺)로 귀경(歸經)한다. 조습화담(燥濕化痰), 강역지구(降逆止嘔)하는 효능이 있어 전통적으로 가래, 기침, 현훈, 두통, 구토, 매핵기(梅核氣) 등에 폭넓게 활용되어 왔다9). 최근 연구에 따르면 반하는 신경보호효과, 진정최면효과, 항구토효과, 항천식효과, 항염증효과 등 다양한 약리학적 활성을 가지고 있다10-13). 흥미롭게도 반하에 포함된 다당류가 cdc42 및 라미닌 수용체(laminin receptor)를 조절함으로써 담관암의 증식을 억제하였고14), 반하에 포함된 pinellia ternata agglutinin이라는 단백질이 간암세포의 세포사멸을 유도함이 보고되어 있어15) 반하가 항암효과를 가짐을 시사한다. 그러나 반하의 항암작용에 대한 연구는 암세포 자체의 조절에만 초점이 맞춰져 있어 반하가 종양연관대식세포에 미치는 영향은 현재까지 연구된 바가 없다. 이에 본 연구에서는 반하 추출물이 RAW 264.7 마우스 대식세포주의 M2 대식세포로의 분극과 암세포로의 이동을 조절할 수 있는지 조사하였으며, 궁극적으로 암세포의 이동능에 영향을 미칠 수 있는지 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법
1. 시료 제조

반하는 ㈜본초마루(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 먼저 반하 50 g을 곱게 파쇄한 후 80% 에탄올 800 ml을 넣어 초음파세척기에서 20분간 sonication 시켰다. Sonication 3회 반복 후 40℃에서 120 rpm으로 교반시키며 48시간 동안 추출하였다. 추출액을 여과하여 모은 후 반하에 다시 80% 에탄올 300 ml를 넣어 40℃에서 120 rpm으로 교반시키며 24시간 동안 2차 추출하였다. 2차 추출액 역시 여과 후 1차 추출액과 합쳐 감압농축 및 동결건조하였다. 그 결과 얻어진 1.87 g의 분말(수율 3.74%)을 dimethylsulfoxide (DMSO; Amresco, Solon, OH, USA)에 100 mg/ml로 녹인 후 사용하였으며, 이를 ETPT(ethanol extract of the tuber of Pinellia ternata (Thunb.) Brei)라고 명명하였다.

2. 세포 배양

RAW 264.7 마우스 대식세포는 동의대학교 최영현 교수님으로부터 분양받았고, THP-1 인체 단핵세포주와 H1299 인체 폐암세포주는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Lewis lung carcinoma (LLC) 마우스 폐암세포주는 부산대학교 하기태 교수님으로부터 분양받았다. THP-1 세포, H1299 세포 및 LLC 세포는 RPMI-1640 (WelGENE, Seoul, Korea) 배지를, RAW 264.7 세포는 DMEM (WelGENE) 배지를 사용하여 배양하였다. 공통적으로 배지 90%에 fatal bovine serum (FBS; WelGENE) 10%와 penicillin-streptomycin (WelGENE) 1%를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 3일에 한 번 주기로 계대배양하였다. THP-1 세포는 100 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)를 24시간 처리하여 대식세포로 분화시킨 후 실험에 사용하였으며, 이를 THP-1 대식세포라고 명명하였다.

3. MTT assay

96 well plate에 RAW 264.7 세포 및 THP-1 대식세포를 각각 1×104개, 3×104개 분주한 후 24시간 동안 안정화시켰다. 다음 날 ETPT를 농도별(0, 10, 25, 50, 100 μg/ml)로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포배양액에 MTT 시약(Duchefa, Haarlem, The Netherlands)을 0.4 mg/ml이 되도록 첨가한 후 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 well의 세포배양액을 제거한 후 바닥에 형성된 formazin을 DMSO 100 μl로 완전히 용해시켰다. 흡광도는 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 측정하였으며, OD값을 기준으로 세포생존율을 계산하였다.

4. Transwell migration assay

대식세포가 암세포를 향해 이동하는 것을 ETPT가 조절할 수 있는지 transwell migration assay로 확인하였다. 먼저 24 well transwell (8.0 μm pore size; Corning, NY, USA)의 upper chamber의 outer membrane 부분을 0.1% gelatin (Sciencell, Carlsbad, CA, USA)으로 코팅하여 30분간 실온에서 굳혔다. 그 후 RAW 264.7 세포와 THP-1 대식세포를 serum이 포함되지 않은 배지에 현탁하여 upper chamber에 각각 3×105개, 5×105개씩 분주하면서 ETPT를 농도별로 처리하였다. Lower chamber에는 H1299 세포로부터 모은 conditioned media (CM)를 500 μl씩 분주하였다. CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 upper chamber를 methanol로 5분간 고정하고, hematoxylin (Sigma‐Aldrich)으로 30분간 염색하였다. 그 후 intermembrane을 도려내어 mounting 후 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하여 이동한 세포의 수를 계수하였다. H1299 세포의 CM은 아래와 같은 방식으로 준비하였다. H1299 세포를 100 π dish에 분주하고, 다음 날 세포배양액을 제거하고 serum이 포함되지 않은 배지 4 ml을 넣어주었다. 이렇게 24시간 배양 후 모은 세포배양액을 필터링하여 CM으로 사용하였다. 다음으로 ETPT가 대식세포의 M2형 분극을 조절하여 궁극적으로 암세포의 이동능에 영향을 미치는지 조사하기 위하여 transwell의 upper chamber에는 serum이 없는 배지에 현탁된 LLC 세포를 3×105개 분주하고, lower chamber에는 RAW 264.7 세포로부터 모은 CM을 500 μl씩 분주하였다. 24시간 배양 후 이동한 LLC 세포를 상기한 방식으로 계수하였다. RAW 264.7 세포의 CM은 아래와 같은 방식으로 모았다. RAW 264.7 세포를 100 π dish에 분주하고 안정화시킨 후 IL-6 (100 ng/ml)를 처리하여 M2형 대식세포로 분극시키면서 동시에 ETPT(100 μg/ml)을 처리하였다. 24시간 배양 후 세포배양액을 제거하고 serum이 포함되지 않은 배지 4 ml을 넣어 또다시 24시간 동안 배양하였다. 이렇게 모은 세포배양액을 필터링하여 CM으로 사용하였다.

5. Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

RAW 264.7 세포를 6 well plate에 분주하여 안정화시킨 후 100 ng/ml IL-4 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 혹은 100 ng/ml IL-6 (PeproTech)를 처리하여 M2형 대식세포로 분극시키면서 동시에 ETPT를 농도별(0, 50, 100 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양 후 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 세포로부터 total RNA를 분리하였다. 1 μg total RNA를 PrimeScript RT reagent kit (Takara, Japan)를 사용하여 cDNA로 합성 후 nuclease-free water에 1:50으로 희석하여 사용하였다. 희석된 cDNA와 타겟유전자에 대한 primer 및 CYBR green (Enzynomics, Daejeon, Korea)을 혼합하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 quantitative real-time PCR 분석을 시행하였다. 사용된 primer 서열과 annealing temperature는 Table 1과 같다.

Table 1. 
Primer sequence and annealing temperature
Gene Sequence (5’→3’) Annealing temperature (℃)
arginase-1 F: AACCAGCTCTGGGAATCTGC
R: TCCATCACCTTGCCAATCCC		 55
mannose receptor C type 1 (MRC-1) F: CTCTGTTCAGCTATTGGACG
R: CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC		 53
IL-10 F: CTCTTACTGACTGGCATGAGGAT
R: GAGTCGGTTAGCAGTATGTTGT		 55
ACTB (β-actin) F: ACTACCTCATGAAGATC
R: GATCCACATCTGCTGGAA		 55

6. 웨스턴블롯

RAW 264.7 세포를 6 well plate에 분주하고, 다음 날 M2형 대식세포로 분극시키기 위해 IL-4(100 ng/ml) 혹은 IL-6(100 ng/ml)를 처리하면서 동시에 ETPT를 처리하였다. 24시간 배양 후 RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)에 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific)과 phosphatase inhibitors (1 mM Na3VO4, 100 mM NaF)가 첨가된 lysis buffer를 이용하여 단백질을 분리하였다. Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질을 정량한 후 20 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE로 분리 및 PVDF 멤브레인(Millipore Corporation, Bedford, MA)으로 transfer하였다. 3% bovine serum albumin (BSA, GenDEPOT, TX, USA)으로 실온에서 30분간 blocking 한 후 blocking buffer로 1:1000 희석한 1차 항체와 4℃에서 overnight 반응시켰다. 다음 날 3% skim milk로 1:10000 희석한 2차 항체와 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 D-Plus ECL Femto System (Donginbio, Seoul, Korea)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. Phosphorylated STAT3 및 total STAT3 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, phosphorylated STAT6, total STAT6 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Goat anti‑rabbit 2차 항체는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였다.

7. 통계 분석

모든 실험 결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 표시하였으며, Student’s t-test를 이용하여 P < 0.05인 것을 통계적으로 유의성 있다고 판단하였다.

결 과
1. 대식세포주의 증식에 영향을 미치지 않는 ETPT 농도 설정

먼저 ETPT가 대식세포의 증식에 영향을 미치지 않는 농도 조건을 설정하기 위하여 RAW 264.7 세포와 THP-1 대식세포에 다양한 농도(0, 10, 25, 50, 100 μg/ml)로 ETPT를 24시간 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과 Fig. 1에 나타난 바와 같이 최고농도인 ETPT 100 μg/ml 처리 후에도 RAW 264.7 세포와 THP-1 대식세포의 생존율이 각각 97.01±8.74%, 105.57±7.81%로 나타났으며, 통계적으로 대조군과 유의한 차이가 나타나지 았다(Fig. 1A and 1B). 따라서 ETPT 100 μg/ml까지는 대식세포의 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 판단하여 100 μg/ml을 최고농도로 이후 실험을 진행하였다.


Fig. 1. 
Effects of ETPT on the cell viability of macrophages. RAW 264.7 cells (A) and THP-1 macrophages (B) were treated with ETPT for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. The data are expressed as the means ± SD of 3 independent experiments. The dotted line indicates the cell viability of 90%.

2. 암세포를 향한 대식세포의 이동능에 ETPT가 미치는 영향

종양연관대식세포 조절을 통한 항암 전략으로서 혈중을 순환하는 단핵세포나 조직 내 상주하는 대식세포가 종양이 위치한 곳으로 유인되는 것을 차단하는 전략이 있다4,6). 이에 ETPT가 대식세포의 암세포로의 이동을 조절할 수 있는지 조사하기 위하여 transwell migration assay를 시행하였다.

먼저 Fig. 2A 및 2D와 같은 방식으로 H1299 인체 폐암세포주로부터 모은 CM을 chemoattractant로 사용했을 때 down chamber로 이동하는 RAW 264.7 세포와 THP-1 대식세포 수를 계수하여 대식세포의 이동 정도를 파악하였다(Fig. 2A and 2D). 그 결과 RAW 264.7 세포와 THP-1 대식세포 공히 ETPT 처리에 의해 농도의존적으로 이동능이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2B and 2E). RAW 264.7 세포의 경우 ETPT 25 μg/ml 처리군에서는 유의한 이동능 감소가 보이지 않았으나, 50 μg/ml 및 100 μg/ml 처리군에서는 대조군에 비해 각각 63.15±4.89%, 12.42±1.74%의 세포만이 이동하여 현저한 이동능 감소를 보였다(Fig. 2C). THP-1 대식세포도 비슷한 경향을 보여 50 μg/ml 및 100 μg/ml 처리군에서 대조군에 비해 각각 66.41±1.71%, 61.12±1.71%의 감소된 이동능을 보였다(Fig. 2F). 이러한 결과는 대식세포가 종양이 위치한 곳을 향해 활발히 이동하는 것을 ETPT가 일부 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.


Fig. 2. 
Effects of ETPT on the migration of macrophages toward cancer cells. (A and D) Experimental schemes of transwell migration assay are shown. RAW264.7 cells (A) and THP-1 macrophages (D) were seeded into the upper chambers of transwell plate and treated with ETPT for 24 h. Conditioned media collected from H1299 human lung cancer cells were filled in the bottom chamber. (B and E) RAW264.7 cells (B) and THP-1 macrophages (E) that migrated through the intermembrane were stained and photographed under a microscope (×100 magnification). (C and F) The relative migration was evaluated by counting the migrated RAW264.7 cells (C) and THP-1 macrophages (F). The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (*** P < 0.001 versus untreated control).

3. ETPT가 M2 대식세포 분극에 미치는 영향

종양연관대식세포 조절을 통한 또다른 항암 전략으로서 종양연관대식세포의 M2형 분극을 차단하는 전략이 있다4,6). M2형으로 분극된 대식세포는 면역억제작용 및 혈관신생 촉진을 통해 암을 악화시키는 인자로 알려져 있기 때문이다6,8). 이에 본 연구에서는 ETPT가 대식세포의 M2형 분극을 조절할 수 있는지 조사하기 위하여 RAW 264.7 세포에 M2 분극을 일으키는 대표적 사이토카인인 IL-6 혹은 IL-4를 처리하면서 동시에 ETPT를 24시간 동안 처리하여 M2 대식세포 마커 유전자의 발현이 어떻게 변화하는지 real-time qPCR을 통해 확인하였다. 먼저 IL-6 (100 ng/ml) 처리에 의해 arginase-1, MRC-1, IL-10 유전자의 발현이 각각 2.72±0.14배, 5.23±0.24배, 35.27±3.02배 증가하여 M2형 분극이 잘 이루어졌음을 확인하였다. IL-6에 의해 증가한 M2 대식세포 마커의 발현은 ETPT에 의해 농도의존적으로 감소하여 50 μg/ml, 100 μg/ml 처리군에서 arginase-1은 각각 대조군에 비해 1.45±0.12배 및 0.65±0.05배, MRC-1은 1.47±0.05배 및 1.11±0.11배, IL-10은 16.92±0.81배 및 11.31±2.01배의 발현량을 나타냈다(Fig. 3A). IL-4 (100 ng/ml)로 M2형 분극을 유도한 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. IL-4 처리 시 arginase-1과 MRC-1 유전자의 발현이 각각 대조군에 비해 4.45±0.3배, 11.58±0.48배 증가하였으며, ETPT 50 μg/ml, 100 μg/ml를 IL-4와 동시처리하자 arginase-1은 각각 2.81±0.26배, 2.61±0.22배, MRC-1은 각각 3.98±0.31배, 3.27±0.39배로 감소하였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 EPTP가 대식세포의 M2형 분극을 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.


Fig. 3. 
Effects of ETPT on the expression of M2 macrophage marker genes in RAW 264.7 cells. (A and B) RAW264.7 cells were stimulated with 100 ng/ml IL-6 (A) or 100 ng/ml IL-4 (B) for M2 polarization and co-treated with ETPT. At 24 h posttreatment, the mRNA level of M2 marker genes was measured by real-time quantitative PCR. The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (*** P < 0.001 versus untreated control, ## P < 0.01, ### P < 0.001 versus the cells treated with IL-6 or IL-4).

4. ETPT가 STAT3 및 STAT6의 인산화에 미치는 영향

다음으로 EPTP가 M2 대식세포로의 분극을 저해할 수 있는 분자적 기전을 탐색하였다. 일반적으로 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) 및 STAT6가 대식세포의 M2형 분극에 관여하는 것으로 알려져 있다16-20). 특히 STAT6는 IL-4나 IL-13으로 유도된 M2형 분극을 매개하며16), STAT3는 IL-4/IL-13 뿐만 아니라 IL-6로 유도된 M2형 분극을 매개한다고 보고되어 있다17-20). 이에 ETPT가 STAT3 및 STAT6의 인산화를 조절할 수 있는지 웨스턴블롯으로 확인하였다. 그 결과 RAW 264.7 세포에 IL-6 처리 시 STAT3의 인산화가 현저히 증가하였으며, ETPT를 함께 처리하자 농도의존적으로 STAT3가 탈인산화 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). IL-4 처리에 의해서도 STAT3와 STAT6의 인산화가 증가하였으며, ETPT 100 μg/ml 처리에 의해 감소하는 것을 관찰하였다(Fig. 4B). 이러한 결과는 ETPT가 STAT3 및 STAT6의 활성을 억제함으로써 IL-6와 IL-4로 유도된 대식세포의 M2형 분극을 저해할 수 있음을 보여준다.


Fig. 4. 
Effects of ETPT on the phosphorylation of STAT3 and STAT6 in RAW 264.7 cells. (A and B) RAW264.7 cells were stimulated with 100 ng/ml IL-6 (A) or 100 ng/ml IL-4 (B) for M2 polarization and co-treated with ETPT. At 24 h posttreatment, the phosphorylation and total level of STAT3 and STAT6 was detected by western blot analysis. Actin was used as an internal control. The representative blot images of three independent experiments are shown.

5. ETPT가 M2 대식세포로 인해 증가한 암세포의 이동능에 미치는 영향

M2 대식세포는 암세포의 전이에 유리한 인자들을 분비하여 암을 악화시키는 것으로 알려져 있다6,8). 이에 IL-6로 유도된 M2 대식세포가 실제로 암세포의 이동을 촉진하는지 여부와 ETPT가 촉진된 암세포의 이동을 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여 transwell assay를 시행하였다.

먼저 Fig. 5A에 제시된 바와 같이 RAW 264.7 세포에 IL-6를 단독처리 혹은 ETPT와 병합처리한 후 CM을 모아 transwell plate의 lower chamber에 분주하고, upper chamber에는 LLC 마우스 폐암세포주를 분주하여 24시간 동안 lower chamber로 이동한 세포를 관찰하였다(Fig. 5A). 그 결과 IL-6를 단독처리 한 RAW 264.7 세포로부터 모은 CM은 LLC 세포의 이동을 대조군에 비해 129.88±9.31%로 현저히 증가시켰으나, IL-6와 ETPT를 동시처리 한 CM은 LLC 세포의 이동을 74.22±7.3%로 다시 감소시켰다(Fig. 5B and 5C). 이러한 결과는 대식세포의 M2형 분극에 의해 암세포의 이동능이 증가하며, ETPT가 이를 억제할 수 있음을 보여준다.


Fig. 5. 
Effects of ETPT on the M2 macrophage-stimulated cancer cell migration. (A) Experimental schemes are shown. The CM collected from RAW264.7 cells treated with IL-6 (100 ng/ml) w/ or w/o ETPT (100 ㎍/㎖) for 24 h was filled in the bottom chambers. LLC cells were then seeded into the upper chambers and incubated for migration for 24 h. (B) LLC cells that migrated through the intermembrane were stained and photographed under a microscope (×100 magnification). (C) The relative migration was evaluated by counting the migrated cells. The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. Significance was determined by the Student’s t-test (** P < 0.01, *** P < 0.001 versus respective control).

고 찰

본 연구는 한의학적으로 거담(祛痰)작용을 가진 대표적 약재9)로서 항암작용이 밝혀진14,15) 반하의 종양연관대식세포 조절에 대한 연구이다. 담음(痰飮)은 체내에 들어온 수액(水液)이 정상적으로 운화(運化)되지 못하고 국소에 머물러 쌓여 있는 병리산물로서 유형의 덩어리를 형성한다는 점에서 암의 주요한 병기(病機)로 인식되어 왔다21. 특히 암세포가 분비하는 다양한 인자들이 혈관내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast), 면역세포(immune cell)와 같은 주변 기질세포들을 종양이 위치한 곳으로 적극적으로 유인함으로써 종양 국소의 정체를 유발하고 궁극적으로 이들을 훈련 및 변화시켜 암의 증식을 더욱 촉진한다22)는 점에서 암의 악화과정에서 암세포와 기질세포와의 복잡한 상호작용은 담음(痰飮)의 병기(病機)와 맞닿아 있다고 봐야할 것이다. 이에 본 연구에서는 대표적 거담제인 반하의 에탄올추출물(ETPT)이 종양미세환경을 구성하는 여러 기질세포 중 종양연관대식세포를 조절할 수 있는지 여부를 대식세포의 종양 내 침윤과 M2형 분극의 두 가지 측면에서 조사하였다.

본 연구의 주된 연구결과 및 시사점은 아래와 같다. 첫째, transwell assay에서 암세포의 CM이 분주된 lower chamber를 향해 이동하는 대식세포의 수가 ETPT에 의해 농도의존적으로 현저히 감소하였다. 이는 ETPT가 대식세포의 종양 내 침윤을 억제함으로써 암세포와 대식세포 간의 활발한 상호작용을 원천적으로 차단할 수 있음을 시사한다. 둘째, real-time qPCR 분석과 웨스턴블롯 분석에서 ETPT는 IL-6 및 IL-4로 유도한 대식세포의 M2 마커 발현을 현저히 억제하였으며, 이는 전사인자인 STAT3 및 STAT6의 불활성화에 의해 매개되었다. M2 대식세포의 대표적 마커인 arginase-1은 상처를 수복하고 T세포 반응을 억제하는 효소로서 IL-4/IL-13에 의해 활성화된 STAT6 혹은 STAT3에 의해 전사가 조절된다8,23,24). MRC-1은 세포막을 관통하는 수용체로서 CD206으로도 불리며, 외부의 당단백질이나 콜라겐 등과 결합하여 internalization 하는데, 염증반응 시 혈중의 염증성 산물들을 제거하여 염증을 해소하는 것으로 알려져 있다8,25). IL-10은 M2 대식세포로부터 분비되어 항염증작용을 나타내는 대표적 사이토카인으로서 이러한 면역억제작용은 STAT3에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다8,26). 이와 같이 M2 대식세포 마커 단백질들은 대부분 면역억제에 관여하여 암을 악화시킬 수 있으므로 이들을 타겟팅하여 차단하는 전략이 대두하고 있으며, ETPT는 M2 마커의 발현을 효과적으로 감소시킴으로써 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 다만 IL-4로 STAT3 및 STAT6를 활성화시켰을 때 ETPT 50 ug/ml 처리군에서는 이들의 인산화가 전혀 감소하지 않아 M2 마커 유전자의 발현을 조절하는 또다른 매개신호가 존재할 가능성이 있다. 이에 대해서는 추후 연구가 필요하다. 셋째, IL-6 처리를 통해 M2형으로 분극된 대식세포는 암세포의 이동을 촉진하였으며, 이는 대식세포에 ETPT를 처리하여 M2형 분극을 억제함으로써 상쇄되었다. 이러한 결과는 ETPT에 의한 M2 분극 억제가 실제로 암세포의 전이를 저해할 수 있음을 시사하는 것으로 ETPT의 종양연관대식세포 조절작용이 직접적인 항암효과를 나타냄을 의미한다.

본 연구의 상기한 시사점에도 불구하고 추후 연구가 필요한 부분이 있는데, 첫째로 ETPT의 어떤 성분이 종양연관대식세포를 조절하는지 구체적으로 밝히는 것이다. 또한 ETPT가 대식세포 뿐만 아니라 암세포의 대식세포 유인능을 조절할 수 있는지 여부도 밝혀야 한다. 일반적으로 C-C Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2), CCL5와 같은 케모카인이나 colony stimulating factor 1 (CSF-1), VEGF와 같은 사이토카인이 암세포로부터 분비되어 대식세포를 유인하는 것으로 알려져 있다2). 만약 ETPT가 이러한 인자들의 분비를 억제할 수 있다면 대식세포와 암세포 간의 상호작용을 더욱 확실하게 차단할 수 있을 것이다. 또한 종양연관대식세포 뿐만 아니라 종양미세환경을 구성하는 혈관내피세포, 섬유아세포 및 면역세포들을 ETPT가 폭넓게 조절할 수 있는지 연구할 필요가 있다. 반하의 항암작용에 대해서는 선행연구가 몇 편 있으나14,15) 반하에 포함된 성분의 암세포 자체에 대한 조절작용에 초점을 맞춘 것으로 기질세포 조절에 대해서는 거의 연구된 바가 없다. 암의 발전과정에서 담음(痰飮)과 어혈(瘀血)의 병기가 중요해지는 시점은 종양이 성장하면서 주변의 기질세포들과 활발하게 상호작용하여 복잡한 종양미세환경을 구축하는 시점으로 생각되는 바, 반하의 항암작용은 암세포 자체보다 종양미세환경 조절에 있을 것으로 예상된다. 본 연구진의 예비연구 결과에서도 반하 추출물은 암세포 자체에 대한 독성이나 세포사멸 유도효과가 미미한 것으로 나타났다. 또한 반하가 자체적으로 가지고 있는 독성으로 인해 강반하(薑半夏) 등의 법제가 이루어지고 있는데, 이러한 법제 과정에서 반하의 항암효과가 변화하는지 여부도 향후 심도 있는 연구가 요청된다.

결 론

반하 에탄올추출물(ETPT)의 종양연관대식세포 조절작용에 대한 연구 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. ETPT는 대식세포가 암세포를 향해 활발히 이동하는 것을 농도의존적으로 억제하였다. 또한 ETPT는 대식세포의 M2형 분극을 억제하였으며, 이는 STAT3 및 STAT6의 불활성화를 통해 매개되었다. M2형으로 분극된 대식세포는 암세포의 이동능을 증가시켰으며, 이러한 효과는 대식세포에 ETPT를 처리하여 M2형 분극을 억제함으로써 상쇄되었다. 이상의 결과는 반하가 종양연관대식세포의 종양 내 침윤과 M2형 분극을 억제함으로써 암의 전이를 저해할 수 있는 가능성을 시사한다.

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