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Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine - Vol. 34 , No. 1
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[ ORIGINAL ARTICLES ]
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine - Vol. 34, No. 1, pp. 7-13
Abbreviation: J Physiol & Pathol Korean Med
ISSN: 1738-7698 (Print) 2288-2529 (Online)
Print publication date 25 Feb 2020
Received 06 Feb 2020 Revised 19 Feb 2020 Accepted 21 Feb 2020
DOI: https://doi.org/10.15188/kjopp.2020.02.34.1.7

RAW 264.7 cell의 염증반응에 대한 散熱飮子의 항염증 효과
김태연*
세명대학교 한의과대학

Effect of Sanyeoleumja on Inflammatory Response of RAW 264.7 Cells
Tae Yeon Kim*
College of Korean Medicine, Semyung University
Correspondence to : *Tae Yeon Kim, College of Korean Medicine, Semyung University, 65 Semyung-ro, Jecheon-si, Chungcheongbuk-do, Korea ·E-mail : violet805@hanmail.net ·Tel : +82-43-649-1339


Ⓒ The Society of Pathology in Korean Medicine, The Physiological Society of Korean Medicine
Funding Information ▼
Abstract

Sanyeoleumja (SY) is the traditional Korean medicinal prescription for the treatment of inflammatory diseases of eyes. In this study, the anti-inflammatory effects of SY water extract were investigated. To measure the anti-inflammatory effects of SY, we examined the productions of inflammatory factor including nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. SY inhibited NO and PGE2 production in a dose dependent manner and decreased the protein and mRNA expression of iNOS and COX-2. Also, SY decreased the mRNA expression of interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β). In conclusion, SY downregulated LPS-induced inflammatory factor productions, which could be a clinical basis for inflammatory diseases.

Keywords: Sanyeoleumja (SY), Anti-inflammatory, Inflammatory factor, NO, PGE2
서 론

염증(inflammation)이란 생체조직에 어떤 유해한 자극을 일으키는 물질이 작용했을 때 나타나는 국소반응으로 생체방어반응의 한 과정이다1). 그러나 과도한 염증반응은 국소 조직의 손상과 변형을 유발하며, 만성화 될 경우에는 건초열, 치주염, 동맥경화증, 류머티스성 관절염 뿐만 아니라 암과 같은 중대한 병변을 초래하므로 염증 관리에 대한 중요성은 나날이 증가되고 있는 실정이다2).

임상적인 염증의 5개 징후는 국소의 疼痛, 發熱, 發赤, 腫脹 및 機能障害이다1). 이러한 징후는 한의학에서 주요 病因으로 알려진 風邪의 發病急暴 및 火熱邪의 熱盛, 炎上, 色赤한 특성과 유사성을 띄고 있으므로 염증질환에 대한 한의학적 病因으로 風熱邪를 꼽을 수 있으며3), 실험적 연구를 통해서도 風邪 제거 효능을 지닌 解表藥이나 熱邪 제거 효능을 지닌 淸熱藥으로 분류된 본초 중 다수가 항염증 효과를 가지고 있는 것으로 밝혀졌으므로 風熱邪가 염증을 유발하는 病因임이 입증되었다4-6). 그러나 한의사들이 임상에서 실제적으로 多用하는 한약이 단일 본초가 아닌 처방의 형태라는 것을 감안할 때, 증거중심의학을 추구하는 의학계의 시류 속에서 한의학 고서에 수록된 다수의 祛風淸熱의 효능을 지닌 처방들이 가진 항염증 효과에 대한 실험적 입증은 그 필요성에 비하여 다소 부족한 실정이다.

효능분류상 解表藥에 속하는 防風과 羌活, 淸熱藥에 속하는 黃芩과 黃連으로 구성되어 祛風淸熱의 효능을 지닌 散熱飮子(Sanyeoleumja, SY)는 『東醫寶鑑․眼門』에 肝臟積熱로 눈이 갑자기 벌겋게 붓고 아픈 것(赤·腫·疼·痛)을 치료하는 것으로 기재되어 있는데7), 현대 사회에서 매년 유병율의 꾸준한 증가로 그 중요성이 나날이 증대되고 있는 안구건조증의 통증, 소양감, 건조감, 충혈, 피로감, 작열감8-10) 등을 치료하기 위하여 임상에서 활용되고 있는 처방이다.

SY의 구성약물인 防風과 羌活의 경우 각각 항염증 효능을 가질 뿐 아니라 倂用시 항염증 활성에 대한 상승작용을 나타내는 것으로 보고되었으며11-13), 黃芩과 黃連의 경우에도 우수한 항염 효과가 보고되었으므로14-16) 이러한 약물들의 복합처방으로 임상에서 활용되고 있는 SY 또한 항염 효과를 가지고 있을 것으로 추측되지만, 이를 실제적으로 확인한 연구는 아직 시행되지 않은 실정이다.

최근 서양의학에서는 안구건조증을 염증질환으로 보고 스테로이드 점안제나 사이클로스포린 점안제를 사용하기도 하는데 이들은 안압 상승, 백내장, 작열감 등의 부작용을 유발하므로17,18), 안전하면서도 효과적인 안구건조증 치료 및 제반 염증질환 치료를 기대할 수 있는 한의학적 치법의 저변 확대를 위한 기초 작업의 일환으로서 SY의 항염증 효과를 확인하는 실험 연구가 필요하다고 여겨진다.

따라서 본 저자는 안구의 염증성 질환을 비롯하여 염증반응을 나타내는 여러 질환에 적용 가능할 것으로 사료되는 SY의 효과를 확인하기 위하여, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cell을 SY 전처리 배지로 배양하고, 자극원인 LPS (lipopolysarccharide) 처리를 한 후 염증매개인자인 NO (nitric oxide)와 PGE2 (prostaglandin E2)의 생성, 전구염증매개효소인 iNOS (inducible nitric oxide synthase)와 COX-2 (cyclooxygenase-2)의 protein 생성 및 mRNA 발현, 펩티드성 염증인자인 cytokines의 mRNA 발현에 미치는 SY의 영향에 대해 관찰하고, 본 논문을 통해 유의성 있는 결과들을 보고하고자 한다.

재료 및 방법
1. 시료 추출

SY 1첩(80 g)은 세명대학교 부속한방병원에서 구매하였다. 시료를 세척한 뒤, 800 ㎖의 증류수를 넣고 4시간 동안 끓여 유효성분을 추출하였다. 추출액은 원심분리기를 사용하여 침전물을 제거하고, 회전증발농축기를 사용하여 100 ㎖가 되도록 감압 농축한 뒤, –80℃ 저온냉장고에서 동결시켰다. 이를 5일간 동결건조기를 사용하여 건조한 후 최종적으로 17.7 g의 분말을 얻었다. 시료는 –20℃에 보관하였으며, 실험 시작 전 배지에 농도별로 희석하여 사용하였다.

Table 1. 
Composition of Sanyeoleumja
Herbal name Pharmacognostic name Weight(g)
防風 Ledebouriellae Radix 20
羌活 Notopterygii Rhizoma 20
黃芩 Scutellariae Radix 20
黃連 Coptidis Rhizoma 20
Total amount 80

2. 세포 배양

RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, South Korea)에서 분양받았으며, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin (P/S)을 포함한 Dulbeco's Modified Eagle's Media (DMEM)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양시켰다. 세포 증식으로 인한 과밀도 현상을 예방하기 위하여 주기적으로 계대배양하였으며 배지 교환은 2일마다 이루어졌다.

3. MTT assay

RAW 264.7 cell을 상술된 배양액에 1 × 106 cells/㎖의 농도가 되도록 섞은 후, 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 이후 SY를 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 다시 24시간 배양한 뒤, 5 ㎎/㎖의 Methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약을 20 ㎕씩 각 well에 넣고 formazan이 생성되도록 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 200 ㎕씩 넣은 뒤 formazan이 잘 녹도록 30분 간 shaking하였다. 이후 새로운 96 well plate에 100 ㎕씩 옮겨 담은 뒤 Synergy 2 microplate reader (BioTek, USA)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 3회의 측정 후, 평균값으로 최종 결과값을 도출하였다.

4. NO assay

RAW 264.7 cell을 상술된 배양액에 5 × 105 cells/㎖의 농도가 되도록 섞은 후, 6 well plate에 2 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 이후 SY를 0, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리된 FBS 미포함 배양액으로 배지를 교환하여 1시간 동안 다시 배양한 후 50 ng/㎖의 농도로 LPS를 추가한 다음 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 새로운 96 well plate에 상등액 100 ㎕을 각각 넣은 뒤 Intron Biotechnology (South Korea)의 Nitric Oxide Detection kit를 이용하여 지시에 따라 처리한 후 Synergy 2 microplate reader (BioTek, USA)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이와 동시에 측정된 Nitrite standard의 흡광도 값을 토대로 표준용량곡선을 작성한 뒤 최종적으로 질소산화물(nitrite, NO2-)의 농도를 계산하였다. 총 3회의 측정 후, 평균값으로 최종 결과값을 도출하였다.

5. PGE2 assay

RAW 264.7 cell을 상술된 배양액에 5 × 105 cells/㎖의 농도가 되도록 섞은 후, 6 well plate에 2 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 이후 SY를 0, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리된 FBS 미포함 배양액으로 배지를 교환하여 1시간 동안 다시 배양한 후 50 ng/㎖의 농도로 LPS를 추가한 다음 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 1.5 ㎖ tube에 상등액을 수거하고 R&D systems(USA)의 PGE2 assay kit를 이용하여 지시에 따라 처리한 후 Synergy 2 microplate reader (BioTek, USA)를 사용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이와 동시에 측정된 PGE2 standard의 흡광도 값을 토대로 표준용량곡선을 작성한 뒤 최종적으로 PGE2의 농도를 계산하였다. 총 3회의 측정 후, 평균값으로 최종 결과값을 도출하였다.

6. Western blot

RAW 264.7 cell을 상술된 배양액에 5 × 105 cells/㎖의 농도가 되도록 섞은 후, 100 ㎜ cell culture dish에 10 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY가 처리된 FBS 미포함 배양액으로 배지를 교환하여 1시간 동안 다시 배양한 후 50 ng/㎖의 농도로 LPS를 추가한 다음 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffer saline (PBS) 10 ㎖로 세척한 뒤 RIPA lysis buffer (Biomax, South Korea)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양은 Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 정량하였으며, 각각 20 ㎍의 단백질을 l0% Mini-PROTEAN TGX™ precast gel (Bio-Rad Laboratories, USA)로 분리하고, PVDF membrane (Bio-Rad Laboratories, USA)으로 transfer 하였다. 이후 Tris-buffered saline Tween 20 (TBS-T)에 용해된 10% skim milk에 membrane을 1시간 동안 실온에서 blocking하고, iNOS, COX-2, β-actin의 primary antibody를 각각 1 : 1000, 1 : 2000 , 1 : 5000으로 희석한 TBS-T에 담그고 4℃에서 overnight 시킨 후 TBS-T로 3분간 5회 washing 하였다. 이후 HRP-conjugated secondary antibody를 1 : 5000 으로 희석한 TBS-T에 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시키고 다시 TBS-T로 3분간 5회 washing 한 후, EZ-Western Detection kit (Dogen, South Korea)로 밴드를 발광시키고 웨스턴이미지분석시스템을 사용하여 분석하였다.

7. Real time PCR

RAW 264.7 cell을 상술된 배양액에 5 × 105 cells/㎖의 농도가 되도록 섞은 후, 100 ㎜ cell culture dish에 10 ㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY가 처리된 FBS 미포함 배양액으로 배지를 교환하여 1시간 동안 다시 배양한 후 50 ng/㎖의 농도로 LPS를 추가한 다음 24시간 동안 추가 배양하였다. RNeasy protect mini kit (Quagen, Germany)로 RNA를 추출한 뒤 QuantiTect Reverse Transcription kit (Quagen, Germany)를 이용하여 reverse transcription하고, QuantiTect SYBR Green PCR kit (Quagen, Germany)를 이용하여 Real time PCR을 시행하였다. Reaction mixture는 cDNA template 2 ㎕, SYBR Green PCR master mix 10 ㎕, primer 5 pM에 RNase free water를 넣어 총 20 ㎕의 양으로 시행하였다. 온도조건은 95℃에서 1분간 전변성 반응 후, 95℃ 15초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 3단계를 1 cycle로 하여 총 45 cycle 반복하였다.

mRNA 발현 정도는 Rotor Gene Q (Qiagen, Germany)를 사용하여 수치화하였다. housekeeping gene인 β-actin은 iNOS, COX-2, IL-6, IL-1β의 mRNA 정량과 분석을 위하여 internal control로 활용하였다(Table 2).

Table 2. 
The Primers for RT-PCR Analysis
Gene Strand Oligonuclotide sequences(5' to 3' direction)
iNOS Sense GTGTTCCACCAGGAGATGTTG
Antisense CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC
COX-2 Sense TGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAA
Antisense CACTAAGACAGACCCGTCATCTCCA
IL-6 Sense GAGTTGTGCAATGGCAATTCTG
Antisense GCAAGTGCATCATCGTTGTTCAT
IL-1β Sense GAAATGCCACCTTTTGACAGTG
Antisense CTGGATGCTCTCATCAGGACA
β-actin Sense AGTGTGACGTTGACATCCGT
Antisense GCAGCTCAGTAACAGTCCGC

8. 통계분석

SPSS 18.0 통계 프로그램 패키지를 사용하여 one way-ANOVA로 군 간 통계학적 분석을 시행하였으며 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결 과
1. 散熱飮子의 세포독성

대식세포의 생존율을 저해하는 SY의 농도를 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 약물 무처리군의 흡광도 평균을 생존율 100%로 설정하고 약물 처리군들의 흡광도 값을 상대적으로 환산한 결과, 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 ㎍/㎖ 농도 처리군들의 상대적 생존율은 100.0±9.4, 111.3±15.6, 111.6±15.9, 107.5±13.6, 106.9±13.7, 103.8±11.8, 98.5±9.4%로, SY를 처리한 전 농도군에서 약물 무처리군과의 유의한 차이는 없었다.


Fig. 1. 
Effects of SY on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 50, 100, 200, 400, 800 and 1600 ㎍/㎖ of SY extracts for 24 h. The amount of viable cells were determined by MTT assay. There were no significant differences between non-treated group and SY extracts treated groups.

2. 散熱飮子의 NO 생성 및 iNOS 단백질과 mRNA 발현 저해

SY가 대식세포의 NO 생성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 NO assay를 시행하였다. 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 NO 생성량은 3.80±2.11 ㎛이었으며, LPS를 단독 처리한 대조군의 경우에는 16.38±2.25 ㎛이었다. 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군의 NO 생성량은 각각 11.23±2.24, 8.09±1.54, 6.55±1.37, 4.64±0.75 ㎛로 대조군과 비교하여 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 2a).


Fig. 2. 
Effects of SY on LPS-stimulated NO production and iNOS protein and mRNA expression in RAW 264.7 cells. (a) Cells were co-treated with SY extracts (50, 100, 200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. Levels of NO in culture supernatants was determined by the Griess reaction. (b) Cells were co-treated with SY extracts (200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. Total iNOS proteins were isolated and analyzed by Western blot. (c) Cells were co-treated with SY extracts (50, 100, 200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. The mRNA level of iNOS was evaluated by real time PCR. β-actin was used as an internal control for realtime PCR. Data were presented as the means ± SEM of triplicate experiments (*** p < 0.001 vs. the LPS alone treated group).

상기 실험에서 확인된 SY의 NO 생성 억제 효과가 iNOS의 발현과 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 Western blot과 RT-PCR을 시행하여 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현을 관찰하였다. LPS를 단독 처리한 대조군의 iNOS 단백질 생성량을 100%로 설정한 후 SY를 처리한 실험군들의 상대적인 생성량을 계산한 결과, 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 경우에는 iNOS 단백질이 관찰되지 않았으며, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군의 iNOS 단백질 생성량은 각각 26.54±10.0%, 2.54±0.9%로 대조군과 비교하여 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 2b). iNOS mRNA의 상대적 발현은 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군과 LPS를 단독 처리한 대조군의 경우 각각 0.002±0.001, 1.000±0.121의 값을 나타내었다. 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군은 각각 0.094±0.022, 0.035±0.020의 값을 나타내어 대조군과 비교하여 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 2c).

3. 散熱飮子의 PGE2 생성 및 COX-2 단백질과 mRNA 발현 저해

SY가 대식세포의 PGE2 생성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 PGE2 assay를 시행하였다. 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 PGE2 생성량은 504±94 pg/㎖이었으며, LPS를 단독 처리한 대조군의 경우에는 1977±131 pg/㎖이었다. 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군의 PGE2 생성량은 각각 1791±132, 1699±160, 1632±90, 1547±121 pg/㎖로 대조군과 비교하여 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 실험군에서 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 3a).


Fig. 3. 
Effects of SY on LPS-stimulated PGE2 production and COX-2 protein and mRNA expression in RAW 264.7 cells. (a) Cells were co-treated with SY extracts (50, 100, 200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. Levels of PGE2 in culture supernatants were measured by ELISA. (b) Cells were co-treated with SY extracts (200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. Total COX-2 proteins were isolated and analyzed by Western blot. (c) Cells were co-treated with SY extracts (50, 100, 200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. The mRNA level of COX-2 was evaluated by real time PCR. β-actin was used as an internal control for realtime PCR. Data were presented as the means ± SEM of triplicate experiments (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 vs. LPS alone treated group).

또한 프로스타글란딘 생합성의 전구체인 arachidonic acid에서 PGE2가 생성되는 과정에 기여하는 COX-2 효소와의 연관성을 확인하고자 Western blot과 RT-PCR을 시행하여 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현을 관찰하였다. LPS를 단독 처리한 대조군의 COX-2 단백질 생성량을 100%로 설정한 후 SY를 처리한 실험군들의 상대적인 생성량을 계산한 결과, 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 경우에는 COX-2 단백질이 관찰되지 않았으며, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군의 COX-2 단백질양은 각각 64.47±5.0, 50.71±4.6%로 대조군과 비교하여 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 3b). COX-2 mRNA의 상대적 발현은 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군과 LPS를 단독 처리한 대조군의 경우 각각 0.001±0.001, 1.000±0.069의 값을 나타내었다. 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군은 각각 0.853±0.069, 0.734±0.067으로 감소되었으며, 특히 400 ㎍/㎖ 농도의 실험군에서는 유의성이 관찰되었다(Fig. 3c).

4. 散熱飮子의 IL-6, IL-1β mRNA 발현 저해

SY가 대식세포에서의 pro-inflammatory cytokine 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현에 RT-PCR 실험을 진행하였다. LPS를 단독 처리한 대조군의 IL-6 mRNA의 상대적 발현값을 1로 설정한 뒤 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 발현값을 계산한 결과 0.000±0.000으로 나타났다. 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군은 각각 0.357±0.048, 0.150±0.021의 값을 나타내어 대조군과 비교하여 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 4a). LPS를 단독 처리한 대조군의 IL-1β mRNA의 상대적 발현값을 1로 설정한 뒤 약물과 LPS를 모두 넣지 않은 무처리군의 발현값을 계산한 결과 0.001±0.000으로 나타났다. 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도의 SY 전처리 후 LPS를 넣은 실험군은 각각 0.138±0.017, 0.097±0.026으로 모두 유의성 있게 감소하는 양상을 보였다(Fig. 4b).


Fig. 4. 
Effects of SY on LPS-stimulated IL-6, IL-1β and TNF-α mRNA expression in RAW 264.7 cells. Cells were co-treated with SY extracts (200 and 400 ㎍/㎖) and LPS (50 ng/㎖) for 24 h. The mRNA levels of IL-6 (a) and IL-1β (b) were evaluated by real time PCR. β-actin was used as an internal control for realtime PCR. Data were presented as the means ± SEM of triplicate experiments (*** p < 0.001 vs. the LPS alone treated group).

고 찰

散熱飮子(Sanyeoleumja, SY)는 조선을 대표하는 의학자 許浚의『東醫寶鑑』에 外障질환 중 하나인 肝臟積熱을 치료하는 처방으로 수록되어 있다. SY는 羌活․防風․黃芩․黃連으로 구성되며 治眼赤腫疼痛의 효능을 가지고 있어 눈이 먼저 빨갛게 붓고 통증이 발생하며 빛을 싫어하고 눈물이 나는 肝臟積熱의 초기 증상에 사용하는데7), 현재 임상가에서는 임상가에서 스마트폰이나 컴퓨터 같은 시각적 전자기기를 다용하는 현대인들에게 많이 발생하고 안구건조증8-10)을 치료하는데 활용되고 있다. SY의 구성 약물인 羌活과 防風은 각각 散表寒·祛風濕, 解表祛風·勝濕·止痛의 약성을, 黃芩과 黃連은 각각 瀉實火·除濕熱, 淸熱燥濕·淸心除煩·瀉火解毒의 약성5)을 가지므로, SY는 전체적으로 크게 風과 熱을 제거하는 祛風淸熱 효능을 지니고 있다고 판단할 수 있다. 염증반응에서 나타나는 疼痛, 發熱, 發赤, 腫脹 및 機能障害1)는 한의학에서 風熱邪로 초래되는 일련의 증상들과 유사한 속성을 띄므로3), 風熱邪를 제거하는 효능을 지닌 SY는 항염증 효과를 발휘할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구자는 SY에 대한 항염증 실험 연구를 진행함으로써 임상가에서 안구건조증 치료에 SY를 사용하는 것에 대한 근거자료로 활용하는 동시에 제반 염증질환에 대한 적용 가능성 밝히고자 하였다.

Macrophage는 lipopolysaccharide (LPS)를 비롯한 수많은 병원체 유래 인자들에 의하여 활성화되는데, 이러한 외부 유래 인자를 탐식하기 위하여 염증매개인자인 nitric oxide, prostaglandin, IL-6, IL-1β 등을 분비하여, 외부 유래 인자 제거를 위한 내재면역계의 효능세포로서 중대한 역할을 수행한다19). RAW 264.7 cell은 마우스로부터 유래된 대식세포주로 유효약물들의 향염증 효능을 검증하고, 염증매개전구인자들이 유도되는 신호전달경로의 억제 효능을 가진 약물을 평가하기 위한 항염증실험의 기본모델로 보편적으로 이용되고 있다20). 본 연구에서 RAW 264.7 cell의 생존율을 저해하지 않는 SY의 농도를 조사한 결과, SY 처리군은 1600 ㎍/㎖ 이하의 모든 농도에서 세포생존율의 저해를 보이지 않았다.

Endothelial nitric oxide synthase (eNOS), neuronal NOS (nNOS), inducible NOS (iNOS)의 3가지 형태로 존재하는 nitric oxide synthases (NOSs)는 인체생리에서 합성과 조절에 있어 중요한 역할을 담당하는 효소군이다21). 이 중 iNOS는 전구염증매개 효소로서 염증조절에 관여하는데, 염증성 질환을 가진 환자의 대식세포에서 대량의 NO를 생성시켜 세균의 침입을 막거나, T cell의 증식을 억제함으로써 국소부위 방어기전에 중대한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다22). 그러나 과도한 iNOS의 발현은 NO 생성을 과도하게 증가시킴으로써, 자체적으로 독성 작용을 유발하여 주변 세포들의 손상을 초래한다23). 본 연구에서 NO 생성에 대한 SY의 효능을 확인한 결과, LPS를 단독 처리한 대조군과 비교하여 50 ㎍/㎖ 이상의 모든 SY 처리군에서 NO 생성 저해 효과가 유의성 있게 관찰되었으며, 또한 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 처리군에서 iNOS 단백질 생성 저하 및 iNOS mRNA 발현 억제도 유의성 있게 나타났다.

iNOS와 더불어 대표적인 전구염증매개효소로 손꼽히는 cyclooxygenase (COX)는 인체에 존재하는 arachidonic acid를 주요 염증매개인자 중 하나인 prostaglandin으로 전환시킨다. 일반적으로 COX는 COX-1과 COX-2의 2가지 형태로 인체에 존재하는데, 이 중 COX-2는 정상적인 생체 조건 하에서는 발현이 거의 미미하나, LPS를 비롯하여 박테리아 독소, cytokines 등의 염증 자극 인자에 의해 촉발되어 다량의 prostaglandin E2 (PGE2)를 생산시킴으로써 염증을 유도한다24-27). 본 연구에서 PGE2 생성에 미치는 SY의 효과를 확인한 결과, LPS를 단독 처리한 대조군과 비교하여 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 처리군에서 PGE2 생성 저하 효과가 유의성 있게 관찰되었으며, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 처리군의 경우 COX-2의 단백질 생성량이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였고, 400㎍/㎖ 농도의 SY 처리군의 경우 COX-2의 mRNA 발현도 대조군과 비교하여 유의성 있게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

염증반응은 인체 내부에 존재하는 다양한 신호전달분자들을 활성화시킨다. 주요 염증반응 병원체인 LPS는 생체에서 펩티드성 염증인자인 cytokines의 생성을 촉진한다21,28). 대식세포는 LPS에 가극되면 IL-6나 IL-1β과 같은 다양한 proinflammatory cytokine을 분비하여 혈관투과성을 증가시키고 염증부위로 염증세포들을 불러들임으로써 염증반응을 가속화시킨다. 이와 같은 cytokines는 자연면역에서 염증반응을 조절하는 매개 조절자로서 그 역할을 수행하고 있으며, 획득면역에서도 특정항원을 인식함으로써 염증반응을 촉진하거나 특수화하는 역할을 수행하는 등 면역반응과 염증반응에서 다양한 역할을 담당한다29-31). 따라서 본 연구에서는 RAW 264.7 cell에서의 IL-6 mRNA와 IL-1β mRNA 발현 변화를 관찰하여, 염증성 질환에 대한 SY의 효과를 확인하고자 하였다.

섬유모세포나 피부각질세포, 단핵구나 B세포, T세포 등을 포함한 여러 종류의 세포에서 분비되는 IL-6는 선천·후천면역 모두에 있어 중요한 역할을 담당하며 간질환의 급성기 반응이나 발열반응을 촉진시키는 주요 인자이다. IL-6는 감염성 질환, 악성종양, 자가면역질환 등에서 증가되어 있으며, LPS나 virus 등에 의하여 상승된다32).

단핵구나 대식세포에서 주로 분비되는 IL-1β는 염증반응의 주요 중재자로, 비만세포를 자극하여 histamine을 유리시킴으로써 혈관투과성을 변화시키거나, 백혈구와 혈관내피세포에 부착된 단백질 발현을 상승시키며, 다양한 lymphokine을 분비시킨다. 또한 중추신경계에서 COX-2를 유도하여 염증성 통증 과민증을 발생시키고 시상하부에서 발열반응을 유도하거나, B 세포와 T 세포를 활성화시키며, 세포증식·분화·사멸과 같은 다양한 세포활동에 관여한다33).

본 연구에서 SY는 LPS로 촉진된 IL-6 mRNA 및 IL-1β mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었으며, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 SY 처리군은 모두 통계적으로 유의성 있는 감소를 보였는데, 이는 SY가 염증매개인자의 생성에 관여하는 세포 내 공통 신호회로를 조절함으로써 염증 억제 효능을 가진다는 것을 시사하고 있다.

상기 결과들을 통해 SY는 iNOS와 COX-2의 생성 및 mRNA 발현 저하, IL-6와 IL-1β의 유전자 발현 저하를 통한 항염증 효능을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 SY는 다양한 염증성 질환을 치료하는 효과적인 한약제제로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

결 론

SY의 항염증 효능을 확인하기 위하여 RAW 264.7 cell을 LPS로 자극한 후 NO 및 PGE2 생성량, COX-2 및 iNOS의 단백질 생성과 mRNA 발현, 주요 cytokines인 IL-6와 IL-1β의 mRNA 발현에 대하여 관찰한 결과, 본 저자는 하단의 결론을 얻었다.

SY는 NO와 PGE2의 생성을 억제한다.

SY는 COX-2와 iNOS의 단백질 및 mRNA 발현을 감소시킨다.

SY는 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현을 감소시킨다.

이상의 결과를 토대로 SY는 항염증효과가 있을 것으로 사료된다.

Acknowledgments

이 논문은 2019학년도 세명대학교 교내학술연구비 지원에 의해 수행된 연구임.

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