미세먼지로 유도된 기관지염증에 다시마가 함유된 복합물의 효과

서 론

사회의 발전과 함께 증가하는 대기오염에 의해 매년 2백만 명 이상이 호흡기 질환으로 사망하며, 그중 미세먼지는 전 세계가 대면한 환경성 질환 위험요인 중 하나로서 다양한 질병을 유발시키면서 국민의 건강을 위협하는 요소다^1,2). 2013년 세계보건기구 산하 국제 암연구소 (International agency for research on cancer; IARC)는 미세먼지를 사람에게 확인된 1군 발암물질 (Group1)로 지정하였다³⁾. 현재 우리나라는 미세먼지 농도가 가장 높은 국가로 지정되어 있으며, 경제협력개발기구 (Organization for economic cooperation and development; OECD)에서 발표한 자료에 의하면 다른 선진국들에 비해 우리나라의 미세먼지 농도는 상당히 높은 편으로 나타났다^4,5). 대기에 있는 총 부유 분진 (Total suspended; TSP) 중 직경 10 ㎛ 이하인 미세먼지 (PM10)와 직경 2.5 ㎛ 이하인 초미세먼지 (PM2.5)는 호흡 시 체내로 침입 가능한 흡입성 먼지 (Respirable dust)로 알려져 있다^6,7). 미세먼지는 질산염 (NO₃^-), 황산염 (SO₄^2-), 암모늄 (NH₄⁺)등의 이온 성분과 탄소화합물, 금속 화합물 등으로 이루어져 있으며, 침적된 미세먼지는 점액섬모 청소 및 기침 등의 호흡기 방어기작에 의하여 체외로 배출되지만 대부분의 미세먼지는 강한 염증을 유발시키고, 흡입 시 하부 기관지 및 폐의 가스-교환 부분까지 침착되어 호흡 기계에 손상을 일으킬 수 있다^7-9). 최근 들어 미세먼지는 심혈관계에 위험요인으로서 심근경색, 뇌졸중, 협심증 질환을 일으킨다고 보고되고 있다¹⁰⁾.

복합물에 가장 많은 비중을 차지하는 다시마 (Laminaria japonica Areschoung)는 우리나라 해역에서 생산되는 대표적인 갈조류로 fucoidan을 함유하고 있다¹¹⁾. Fucoidan은 미역, 다시마, 톳 등의 갈조류의 세포벽 성분인 점질 다당에 함유되어 있는 수용성 다당류다. 혈액 중에 존재하는 heparin과 생리적 특성이 비슷하여 thrombin의 활성을 억제하여 혈액응고 억제작용을 하며 항혈액응고, 항암작용, 암세포 증식을 억제, 면역조절작용, 신장 개선 등의 기능적 특성이 밝혀졌다^12-17). 또한 주요 성분인 길경 (Platycodon grandiflorum A. De Candolle), 사삼 (Adenophora triphylla var. japonica Hara), 맥문동 (Liriope platyphylla Wang et Tang), 오미자 (Schisandra chinensis Turcz. Baillon)는 기관지염, 호흡곤란 등 호흡기 질환에 많이 사용되며, 혈당강화작용, 항염작용, 면역효과 및 항산화 효과 연구들이 진행되어 있다^18-24).

그 외 갈근 (Pueraria lobata Ohwi), 백출 (Atractylodes macrocephala Koidzumi)은 항산화 작용, 항천식 작용, 항암효과가 있다고 보고되고 있으며^25,26), 백복령 (Wolfiporia extensa), 연자육 (Nelumbo nucifera Gaertner), 진피 (Citrus reticulata Blanco)는 면역증강 및 항암제 치료, 항산화 작용으로 보고되어 있다^27-32).

다시마가 함유된 복합물은 기관지염, 면역증강 및 항암제 치료에 많이 쓰이고 있는 한약재들을 함께 혼합하여 만든 약재로서 아직 미세먼지로 유발한 기관지 염증에 대한 효과를 비교한 연구는 보고된 바가 없다.

이에 본 저자는 페포상피 세포주인 A549 세포주 모델과 생쥐의 기도 내 미세먼지 흡입을 한 동물 모델을 이용하여 복합물의 미세먼지 유발 기관지 염증 보호 및 치료약물로서 기능성을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

1. 시료제작

다시마가 함유된 복합물 (Laminaria japonica Areschoung mix 이하, LAM으로 표기)의 구성 약재들은 대전한약국 (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 한 첩의 내용 및 분량은 Table 1과 같다.

Table 1.

The Prescription of LAM

6. 유전자 발현량 측정

1) RNA 추출

6 well plate에 A549 세포를 2×10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 LAM을 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 30분 뒤, 각각 10 ㎍/㎖의 LPS를 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 얻은 세포에 easy blue 1 ㎖와 chloroform 200 ㎕를 넣고 vortexing 해준 후, 13000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액 400 ㎕와 binding buffer 400 ㎕를 실온에서 1분 동안 반응시킨 뒤 반응액 700 ㎕를 column에 주입하여 13000 rpm에서 30초 동안 원심분리 하였다. Column에 washing buffer A를 700 ㎕ 넣고 13000 rpm에서 30초 동안 원심분리 후, washing buffer B를 700 ㎕ 넣고 동일하게 원심분리하였다. Column 하단을 1.5 ㎖ tube로 교체한 후, column에 elution buffer를 30 ㎕ 넣고 1분 동안 반응시킨 뒤 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리 하여 total RNA를 추출하였다.

2) cDNA 합성

역전사 (Reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (Reaction buffer, dNTPs mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)와 total RNA를 1 ㎍ 넣고 DEPC-DW을 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 첨가하였다. 이 혼합액을 잘 섞은 후, 45℃에서 60분 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하고, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시켜 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.

3) 유전자 증폭

합성이 완료된 cDNA를 증폭시키기 위하여 real-time PCR을 진행하였으며, real-time 전용 tube에 cDNA 1 ㎕, 각 primer 2 ㎕, SYBR Green 10 ㎕, DEPC-DW 5 ㎕씩 넣어 95℃에서 2분 동안 반응시키고 다음 95℃에서 5초, 62.5℃에서 30초를 40회 반복하여 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군에 비하여 계산하였으며, 사용된 primer의 sequence는 Table 2와 같다.

Table 2.

The Sequences of Primers

9. 모델 제작 및 시료 투여

미세먼지 유도 모델을 제작하기 위해 먼저, coal fly ash와 diesel particulate matter를 각 5 ㎎/㎖ 농도로 DMSO에 용해 시킨 후 최종 농도가 coal fly ash는 0.5 ㎎/㎖, diesel particulate matter은 0.75 ㎎/㎖가 되도록 PBS로 희석한 후 수산화알루미늄 겔이 8 %가 되게 첨가하여 미세먼지 혼합물을 제조하였다. 미세먼지 혼합물의 투여는 시료 투여 시작 후 3일, 6일 후에 총 2회로 INT (Intra-Nasal-Trachea) 방법을 이용하여 미세먼지 혼합물을 50 ㎕씩 주입하였다. 실험은 미세먼지를 주입하지 않은 정상군, 미세먼지 유도 마우스에 증류수를 경구 투여하는 대조군, 미세먼지 유도 마우스에 LAM을 200, 400 ㎎/㎏/day으로 경구투여 하는 실험군 등으로 분류 하였으며, 각 그룹은 8수씩 무작위로 배정하였다. 2주간의 동물 적응기를 거친 후, 14일간 1일 1회 오전 10시에 경구투여 하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

The animal experimental scheme.

결 과

1. 세포생존율

A549 세포에서 세포 생존율을 측정한 결과, LAM 400 ㎍/㎖ 농도를 제외한 모든 농도에서 대조군만큼 높은 생존율을 나타내었다 (Fig. 2).

Fig. 2.

Cell viability test of LAM in A549 cells. A549 cells were treated by 50, 100, 200 and 400 ㎍/㎖ of LAM for 24 h. Treated cells were reacted by EZ-Cytox for 30 min and then absorbance were measured at 450 ㎚ using micro plate reader. Cell viability were calculated as percentage relative to the control. The result were presented by the mean ± S.D from three independent experiments.

2. 세포 내 유전자 발현량

LPS를 이용한 알레르기 염증 유발 후, 기관지 상피세포에서 발현이 증가되는 IL-8, COX-2, MCP-1 유전자 발현량을 측정한 결과, LAM는 농도 의존적으로 대조군에 비해 유의성 있는 (** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001) 유전자 발현 감소가 나타났다(Fig. 3).

Fig. 3.

Effect of LAM on mRNA expression level in A549 cells. A549 cells were treated 50, 100, and 200 ㎍/㎖ of LAM with 10 ㎍/㎖ LPS for 12 h. The mRNA expression level were measured by polymerase chain reaction. The result were presented by the mean ± S.D from three independent experiments (Significance of results, +++ ; p < 0.001 compared to normal, ** ; p＜ 0.01, *** ; p＜ 0.001 compared to control). (A); IL-8, (B); COX-2, (C); MCP-1

3. 세포 내 바이오마커 생성량

IL-8은 활성화 되어진 호산구 화학 주성에 작용하여 기도 염증을 유발 시키는 역할을 하며, IL-8 생성량을 측정한 결과 LAM 200 ㎍/㎖의 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** ; p <0.01) 감소가 나타났다. 염증에 의해 자극되는 COX-2에 의해 생성된 PGE₂와 직접적으로 기도과민성을 유도하는 MUC5AC 생성량을 측정한 결과, LAM는 농도 의존적으로 대조군에 비해 유의성 있는 (* ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001) 바이오마커 생성량 감소가 나타났다(Fig. 4).

Fig. 4.

Effect of LAM on biomarker level in A549 cells. A549 cells were treated 50, 100, and 200 ㎍/㎖ of LAM with 10 ㎍/㎖ LPS for 12 h. The biomarker level were measured using a ELISA kit. The result ere presented by the mean ± S.D from three independent experiments (Significance of results, +++ ; p <0.001 compared to normal, * ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001 compared to control). (A); IL-8, (B); PGE2, (C); MUC5AC

4. 점액분비량

호흡기 내의 이물질 배출과 점막을 보호하는 역할을 하는 점액의 분비량 측정 결과, LAM 400 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비해 점액 분비량을 유의성 있게 (** ; p< 0.01) 증가하였다(Fig. 5).

Fig. 5.

Effect of LAM on phenol red secretion level in trachea of fine dust-injected mice. The result were presented by the mean ± S.D (n=6)(Significance of results, +++ ; p <0.001 compared to normal, ** ; p < 0.01 compared to control).

5. 면역세포 수

세균 감염 및 바이러스 감염 등 염증반응 유도 시 증가되는 백혈구, 림프구, 단핵구, 백혈구 속 가장 많은 비중을 차지하는 호중구는 LAM을 투여한 모든 투여군에서 농도의존적으로 대조군에 비해 유의성 있는 (* ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001) 면역세포 수 감소가 나타났다(Fig. 6).

Fig. 6.

Effect of LAM on immunocyte count in fine dust-injected mice. The result were presented by the mean ± S.D (n=6). (Significance of results, +++ ; p < 0.001 compared to normal, and * ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001 compared to control). (A); white blood cell, (B); neutrophil, (C); lymphocyte, (D); monocyte

6. 혈청 내 바이오마커 생성량

기도 내 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, Histamine, PGE₂의 혈청 내 바이오 마커 생성량을 측정한 결과, LAM의 모든 투여군에서 대조군에 비해 유의적인 (* ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001) 염증성 cytokine 감소가 나타났다(Fig. 7).

Fig. 7.

Effect of LAM on biomarker level in fine dust-injected mice. The result were presented by the mean ± S.D (n=6). (Significance of results, +++ ; p < 0.001 compared to normal, and * ; p<0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001 compared to control). (A); interleukin-1 beta, (B); inerleukin-6, (C); interleukin-8, (D); tumor necrosis factor alpha, (E); histamine, (F); prostaglandin E2

7. 면역글로불린 수준

면역글로불린E는 비만세포 표면에 있으며 면역글로불린E와 결합된 항원은 천식을 유발하는 화학물질 배출을 유도시킨다. 면역글로불린E 수준을 확인한 결과 LAM은 모든 농도의 투여군에서 농도의존적으로 대조군에 비해 유의적인 (*** ; p < 0.001) 감소가 나타났다(Fig. 8).

Fig. 8.

Effect of LAM on immunoglobulinE level in fine dust-injected mice. The result were presented by the mean ± S.D (n=6). (Significance of results, +++ ; p < 0.001 compared to normal, and * ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, *** ; p < 0.001 compared to control).

고 찰

우리나라는 1960년대부터 시작된 산업화와 경제 성장으로 인하여 에너지 사용량이 증가하고 있으며, 자동차, 빌딩, 사업장의 대기 오염물질 배출 증가로 인하여 인체에 미치는 영향에 대한 사회적 관심이 증가하고 있다³³⁾. 미세먼지는 입자의 크기에 따라 PM10, PM2.5로 나누며, 주로 기관지에 염증반응을 일으키면서 호흡기 장애를 발생하게 되며, 흡입 시에 하부기관지 및 폐의 가스-교환부분까지 침착하게 되어 밀착 (Impaction), 침전 (Sedimentation), 확산 (Diffusion)으로 흡수 된다^10,34). 대기 중 미세먼지의 노출에 의해 호흡기증상의 증가, 심혈관계 부정적 영향, 어린이 폐 기능 감소, 만성폐쇄성 폐질환 (Chronic obstructive pulmonary disease: COPD)환자 증가 등을 초래한다고 보고되었다^35,36). 미세먼지의 입자 크기가 작을수록 기저 호흡기 질환을 악화시키고 활성산소 생성을 통해 염증성 사이토카인을 증가 시킨다³⁷⁾.

한의학에서는 호흡기 질환을 장부변증, 팔간변증을 이용하여 변증 분류하고 있으며, 喀痰은 痰飮의 범주로 체내의 한 부분에 과다한 수분이 정취 된 것으로 질병의 원인 및 질병의 결과로 발생되는 병적 상태다³⁸⁾. 喀痰 및 痰과 관련하여 ≪素問‧通評虛實論≫에서 喘息은 “幼者中風熱 喘鳴肩息”이라 하여 風熱邪氣에 의하여 유발될 수 있다고 보고하고 있다³⁹⁾.

昆布, 沙蔘, 麥門冬, 五味子은 기관지 염증 증상의 치료에 더불어 다양한 증상에 활용되며, 葛根, 沙蔘, 白茯苓, 白朮, 蓮子肉, 陳皮의 부산물 역시 염증 증상의 치료에 사용되고 있다고 보고되고 있으나^18-32), 이들의 복합처방인 LAM은 문헌적으로 효능이 기록되지 않고 실험적 연구 역시 진행된 바가 없다.

먼저 A549 세포를 이용하여 LAM 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖ 처리한 결과, 400 ㎍/㎖을 제외한 모든 농도에서 세포증식이 일정하게 유지되어 약물 자체에 독성이 없는 것으로 판단되었다(Fig. 2). LPS (Lipopolysaccharide)는 염증 매개 물질에 생성과 분비를 유도하는 중요한 인자로 TLR 수용체의 활성화를 통해 염증을 유도 하는 물질이다⁴⁰⁾. 이에 본 실험은 A549 세포 염증 유발 물질로 LPS를 사용하였다.

염증반응에서 Th1 (T-helper type 1) 타입은 Th type 1 cytokine의 IL-12 (Interleukin-12), IFN-γ (Interferon- γ) 등을 생산하여 박테리아 감염과 같은 intracellular pathogen에 대항하는 면역반응에 관여하지만, Th2 (T- helper type 2) 타입의 면역반응 증가는 천식 및 호흡기 질환 진행에 있어 매우 중요한 원인이다^41,42). Th2 타입은 IL-1 (Interleukin-1), IL-3 (Interleukin-3), IL-4 (Interleukin-4), IL-5 (Interleukin-5), IL-6 (Interleukin-6), IL-13 (Interleukin-13) 및 TNF-α (Tumor necrosis factor α) 등 Th2 cytokine을 생산하여 면역글로불린E 합성과 염증이 유발된 기도에서 호산구의 축적에 중요한 역할을 한다⁴³⁾. 이러한 cytokine 중 IL-1, IL-6, TNF-α 등은 증가된 히스타민 분비와 염증성 세포의 반응에 관여하는 chemokines을 포함하여 기도 내의 염증을 유발하는 cytokine이다⁴⁴⁾. IL-8은 CXC chemokine subfamily에 속하며 기도에서 염증 부위로의 세포 이동을 매개하는 chemokine으로 주공급 세포는 기관지 상피세포로서 알레르기 염증 반응에 밀접한 관련을 가지며, 천식 환자의 기관지 상피세포에서 발현이 증가한다⁴⁵⁾. Cyclooxygenase (COX) 중 COX-2는 염증 자극에 의해 발현되고, COX-2에 의해 생성된 Prostaglandin E₂ (PGE₂)이 염증반응과 세포증식에 관여한다⁴⁶⁾. 특히 chemokines은 기도과민성 및 기관지 염증반응에 상관관계가 있으며 이들 중 MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1)은 비만세포를 활성화시키고 기도로 leukotriene C4가 분비되도록 하여 기도과민성을 직접적으로 유도한다⁴⁷⁾. 기도 상피 세포내의 점액 유전자 중 MUC5AC 유전자에 의해 합성되는 당단백은 정상인과 천식 환자에서 기도 분비액의 주된 성분으로 알려져 있으며 기도 내 배상세포 증식 및 화생과 가장 관련성이 있다고 보고되었다^48,49). 호산구는 천식 알레르기 반응에 중요하게 작용하며, 조직을 직접 파괴하여 히스타민 분비를 촉진시킨다. 이후 기관지 과민성을 증가시켜 기관지를 수축시키고 모세혈관 확장을 일으킨다⁵⁰⁾. 리아진 항체인 면역글로불린E는 helper T cell과 suppressor T cell의 조절 기능에 의해 그 생성이 결정되며, 알레르기 반응에 중요한 역할을 한다⁵⁰⁾.

A549 세포에 LPS 염증 처리를 한 후 LAM의 염증 개선 효과를 확인한 결과 IL-8, COX-2, MCP-1의 유전자 발현량은 농도 의존적으로 감소하였고 세포 내 바이오마커 생성량을 비교했을 때 IL-8, PGE₂, MUC5AC의 발현량 모두 농도의존적으로 감소함을 보였다(Fig. 3, 4). 또한 미세먼지로 폐 염증반응을 유도하여 LAM을 경구투여한 동물의 혈청 바이오마커 생성량을 측정한 결과 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, histamine, PGE₂의 발현량과 면역글로불린E 발현량 모두 농도의존적으로 감소함을 보였다(Fig. 7, 8). 따라서 LAM은 미세먼지가 탐식세포나 상피세포를 자극하여 증가된 염증성 cytokine을 감소시키며, 염증 반응을 촉발 하는 면역글로불린E를 감소 시킴으로서 기도염증과 폐질환 및 폐 감염을 예방하는 것을 예상할 수 있다.

점액은 몸 밖에서 유입되는 유해물질에 대한 세포의 독성물질을 비활성화 시키는 역할을 하며. 호흡기 내의 이물질 배출과 점막을 효과적으로 보호하는 역할을 한다고 보고되어져 있다.⁵¹⁾. 점액 분비량을 측정한 결과 LAM 400 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타났다(Fig. 5).

또한 면역세포수를 비교한 결과, 미세먼지를 유도한 대조군에 비해 LAM을 투여한 실험군에서 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구 수가 유의적으로 감소하였다(Fig. 6).

이상의 결과들을 종합해 볼 때, 미세먼지를 유도한 ICR mouse에 LAM 투여는 정상군에 비해 감소된 면역세포 수, 염증 관련 바이오마커 및 면역글로불린 함량을 낮춰주며 호흡기 질환 발현에 효과적인 기능성 소재로서의 가능성이 확인되었다.

결 론

본 연구는 미세먼지로 유발한 호흡기 질환에 대한 LAM의 치료 및 효능을 과학적으로 검증하고자 폐포상피세포주인 A549 세포에 LAM을 50, 100, 200 ㎎/㎖ 농도로 처리한 후 염증 관련 세포 내 유전자 발현량과 바이오마커를 확인하였을 때 모두 농도 유의적으로 감소하였으며, 생쥐의 기도 내 미세먼지 흡입을 통한 동물 모델을 이용하여 LAM을 200, 400㎎/㎏ 농도로 실험동물에게 총 14일간 경구투여 함으로서 점액분비량, 면역세포 수 및 혈청 내 바이오 마커 분석을 통해 확인한 결과, 점액분비량을 증가시켰으며, 바이오마커 생성량 및 면역세포 수를 농도 의존적으로 감소시켰다. 이러한 결과를 통해 LAM은 미세먼지로 인해 발생하는 호흡기질환을 억제함을 보여주었다. 이후, 인체 적용 시험 및 품질 개선에 대한 연구가 진행된다면 효과적인 천연물 소재로서 활용이 가능할 것으로 사료된다.

Acknowledgments

이 논문은 2018학년도 대전대학교 교내학술연구비 지원에 의해 연구되었습니다.

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